Трофность паразитов
По типу питания микроорганизмы разделяют на сапротрофов, некротрофов и биотрофов. Первые извлекают питательные вещества из мертвых тканей, т. е. являются сапрофитами, вторые и третьи — паразиты. Однако некротрофы прежде чем оккупировать какой-либо участок растения, убивают его своими токсичными выделениями, т. е. фактически, как и сапротрофы, питаются содержимым мертвых клеток, а биотрофы извлекают питательные вещества непосредственно из живых клеток. Различия между ними заключаются в соотношении скоростей гибели зараженной ткани (некроза) и развития паразита в растении. Если некроз опережает распространение паразита, следовательно, тип питания некротрофный, если же распространение паразита опережает некроз, — питание биотрофное.
Существуют переходные формы между некротрофами и биотрофами — гемибиотрофы, которые имеют смешанное питание. Сначала они питаются биотрофно, затем, после гибели зараженной ткани, продолжают развиваться в ней, питаясь некротрофно. А возбудитель парши яблони Venturia inaequalis образует внутритканевой (эндофитный) мицелий между мезофиллом и эпидермисом, не повреждая клеток (биотрофно), затем, после гибели клеток, распространяется в них некротрофно, и, наконец, после отмирания и опадения листьев продолжает развиваться в них сапротрофно.
При некротрофном паразитизме воздействие на клетки хозяина более грубое, чем при биотрофном, некротрофный тип питания менее специализированный и, по-видимому, является первичным. Эволюцию типов питания от сапротрофии к биотрофии можно проследить у почвообитающих грибов, среди которых можно обнаружить различные переходные виды.
Корни растений выделяют в окружающую среду большое число метаболитов, как полезных для почвенных микроорганизмов (аминокислоты, сахара и т. п.), так и токсичных для них (фитонциды), концентрация которых падает по мере удаления от корня. Организмы, приобретшие устойчивость к вредным метаболитам, получили возможность обитать вблизи корней, используя полезные. Возникла специфическая микрофлора ризосферы (вокруг корней) и ризопланы (на поверхности корней). Взаимоотношения ризосферных микроорганизмов с растениями близки к комменсализму, ибо растение оказывает на них отчетливое положительное влияние, в то время как влияние микроорганизмов на растение незначительно. У ризосферных микроорганизмов можно обнаружить некоторую специализацию к видам растений.
Ризосферные микроорганизмы растут в направлении градиента концентрации метаболитов, диффундирующих из корней. Диффузия веществ резко усиливается в результате ранения поверхности корня. Наиболее неспециализированная и примитивная группа некротрофных паразитов — раневые некротрофы, по-видимому, возникли из ризосферных микроорганизмов. Показано, например, что зооспоры раневого паразита гриба Pythium ultimum концентрируются около пораненного участка корня. Другой раневой паразит Rhizoctonia solani имеет оптимум развития на искусственной среде при температуре 25°, в то время как наиболее сильно поражает корни хлопчатника при температуре 17°. Такая разница температурных оптимумов обусловлена тем, что корни хлопчатника при 18° выделяют в окружающую среду в 7 раз больше аминокислот и сахаров, чем при 30°. Раневые паразиты могут неопределенно долго развиваться сапротрофно в почве (факультативные паразиты) и обладают разнообразными антибиотическими веществами, необходимыми для конкуренции за субстрат с другими микроорганизмами; они не способны проникать через неповрежденные участки растений. Попадая в ранки, они выделяют в ткань хозяина токсические продукты (фитотоксины), которые убивают клетки, расширяя некроз — плацдарм существования паразита, и часто вызывают гибель всего растения. После этого они продолжают развиваться на растительных остатках сапротрофно.
Таким образом, инфекционную грибную гифу или бактериальную клетку к ранам привлекают метаболиты, выделяющиеся в окружающую среду. Так у опухолеобразующей бактерии Agrobacterium tumefaciens, заражающей растения только через ранки, экспрессия vir-генов (от англ. virulence), которые необходимы для протекания морфологических и метаболических изменений, связанных с заражением растений, происходит под воздействием ацетосирингона и других фенолов, синтез которых индуцируется у растений механическим повреждением и которые диффундируют из ран в окружающую среду. Фенольные соединения, в частности флавоноиды, индуцируют формирование гаусториев даже у цветковых растений-паразитов.
Поскольку наличие раневой поверхности стимулирует синтез раневой перидермы, которая, во-первых, заделывает механические бреши, и, во-вторых, препятствует выделению химических аттрактантов, заражение раневыми паразитами эффективно только сразу после ранения. Так процент успешных заражений кукурузы антракнозом (возбудитель Colletotrichum graminicola) в момент нанесения ранки составил около 70 %, через 1 час — 22 %, а через 6 часов — менее 5 %. Поэтому наиболее эффективно заражение растений паразитами, которые передаются насекомыми-фитофагами. Например, жуки-короеды, несущие на поверхности тела (в том числе и на ротовом аппарате) споры возбудителя голландской болезни вязов Ophiostoma ulmi питаются цветками ильмовых пород и заносят споры в ранки, сделанные при питании. Клетки возбудителя бактериального ожога семечковых Erwinia amylovora разносятся на теле пчел и других опылителей и попадают в ранки, сделанные этими сосущими насекомыми.
Следующий эволюционный этап — дальнейшее развитие некротрофного паразитизма. Он связан с несколькими свойствами некротрофов.
1. Приобретение способности внедряться в неповрежденные части растения, прободением кутикулы и верхней стенки эпидермальных клеток или через устьица. Прободение клеточных покровов осуществляется механическим давлением и ферментативной деградацией составляющих их полимеров.
Механическое прободение. У многих фитопатогенных грибов проросток споры заканчивается утолщенной нашлепкой — апрессорием. Формирование апрессориев индуцируется кутикулярным воском, поэтому проростки спор фитопатогенных грибов не образуют апрессориев на листьях, с которых удалена кутикула, и in vitro.
Подошва апрессория, как и вся грибная гифа плотно прикрепляется к гидрофобной поверхности за счет разнообразных соединений, находящихся на ее поверхности.
1. Интегрин, как медиатор взаимодействий. Интегрины — семейство животных белков, которые пронизывают клеточную мембрану и, взаимодействуя с рецепторами интегринов соседних клеток, обеспечивают клеточную адгезию. Поскольку цитоплазматический «хвост» молекул интегрина короткий и не подвержен энзиматическому узнаванию, они через адаптерный белок, связывающий интегрин с цитоскелетом, протеинкиназами и трансмембранными рецепторами факторов роста, осуществляют трансдукцию сигнала. Этот путь трансдукции назван интегриновым кластером. Интегрины обнаружены у грибов и оомицетов.
Они необходимы для апикального роста гифы, ориентации микрофиламентов цитоскелета и прикрепления гиф к поверхности, а также обеспечивают тигмотропизм — рост гифы строго перпендикулярно антиклинальным клеточным стенкам эпидермальных клеток (такой рост облегчает нахождение устьиц).
2. Гидрофобины. Среди рано экспрессируемых генов Magnaporthe grisea изолирован ген MPG1, продукт которого — низкомолекулярный белок гидрофобии необходим для прикрепления гифы к гидрофобной поверхности листа и образования инфекционных структур (апрессориев).
3. Муцин. У Phytopthora infestans группа генов из семейства Car кодирует внеклеточные белки, сходные с муцином позвоночных. Эти белки экспрессируются в прорастающих цистах и апрессориях перед их внедрением и служат для адгезии на поверхности растения.
4. Белки, связывающиеся с целлюлозой (CBL-proteins), обеспечивают адгезию гиф Phytopthora parasitica с целлюлозосодержащим субстратом. Клеточная стенка подошвы апрессория двухслойная, состоит из тонкой наружной и более плотной внутренней оболочек. В оболочке, возвышающейся над субстратом, у многих грибов откладывается меланин — темноокрашенный пигмент, синтезирующийся полимеризацией поликетидного предшественника 1,8-дигидронафталина (рис. 1.1). Откладываясь в клеточной стенке апрессория, не контактирующей с поверхностью листа, меланин играет роль молекулярной ловушки, повышающей тургорное давление внутри апрессория и способствующей росту инфекционной гифы внутрь листа. Высокое тургорное давление, развивающееся в апрессории, приводит к разрыву наиболее тонкой наружной оболочки подошвы и пробиванию клеточных покровов прорастающей вниз инфекционной гифой, которая покрыта внутренней оболочкой апрессория. Например, апрессорий возбудителя пирикуляриоза риса гриба Magnoporthe grisea (конидиальная стадия — анаморфа Pyricularia oryzae) развивает давление, равное 8 миллипаскалей; для создания клеткой такого давления необходимо, чтобы концентрация растворов в ней превышала 3 м. Мутанты, имеющие светлоокрашенные апрессории, не инфекционны. В биосинтезе меланина участвуют три несцепленных гена ALB1 RSY1 и BUF1. Их мутации придают мицелию и гаусториям белую, розовую или темножелтую окраску соответственно. Первый из этих генов контролирует синтез поликетидсинтетазы, второй — сциталондегидратазы, третий — НАДФ-зависимой полигидроксилнафталин редуктазы.
В апрессориях М. grisea экспрессируется белок Psilp, который гомологичен семейству мембранных белков животных тетраспаринов. Эти белки входят в комплекс мембранного сигналинга, ответственного за клеточную адгезию, дифференциацию и движение. Te же функции — адгезию и дифференциацию контролирует этот белок и в мембранах гаусториев. Интересно, что мРНК psil обнаружена во всех клетках, а белок — только в гаусториях, т. е. его регуляция осуществляется на уровне трансляции.
Белки сар20 и сар22 — гликопротеины, связанные с клеточной стенкой апрессория. Один из них нужен для формирования гаустория, второй — для его функционирования. Локализованный в мембране гаусторий белок P1G1, 19 гомологичен гену дрожжевой пермеазы — фермента осуществляющего транспорт аминокислот через мембрану. Наконец, в цитоплазме апрессориев обнаружен белок ACE1 с комбинированными ферментными свойствами поликетидсинтетазы / нерибосомальной пептидсинтетазы. Продукт его ферментативной активности неизвестен, но, возможно, играет роль на ранних этапах взаимодействия гаустория с клетками хозяина.
Для морфогенетических процессов, связанных с формированием апрессориев у Magnaporthe grisea необходим белок металлотионин размером 22 кДа, который имеет высокую аффинность к цинку, и пероксисомные белки, из которых сформированы тела Воронина, образующие плотные пробки в септальных перегородках аскомицетов.
Менее исследованы процессы внедрения грибных гиф в корни растений. Вместо меланизированных апрессориев на мицелии формируются небольшие выросты — гифоподии, с помощью которых происходит внедрение в ткань корня. У Fusarium oxysporum изолирован митохондриальный белок FOW1, необходимый для колонизации корней. Делении контролирующего гена вызывают редукцию патогенности, но не влияют на рост гриба in vitro.
Химическая деградация клеточных покровов. Фитопатогенные грибы и бактерии обладают большим набором ферментов, разрушающих углеводные полимеры, из которых построены клеточные стенки растений. Во-первых, с помощью этих ферментов паразит проникает в клетку и питается ее содержимым. Во-вторых, эти ферменты у некротрофных паразитов настолько активны, что снимают стенку с большей части клетки; лишенный прочного каркаса протопласт разрушается вследствие осмотических явлений, и клетка погибает, теряя иммунные свойства живого. В-третьих, разрушая срединную пластинку (межклеточный цемент, склеивающий клетки в ткани), паразиты приобретают возможность продвигаться в зараженной ткани растения. Наконец, в-четвертых, продукты деградации полимеров клеточной стенки — моносахариды, используются паразитами для питания.
2. Увеличение продолжительности пребывания паразита в растительных тканях вследствие более мягкого или локального токсического действия.
Как видно, движущая сила эволюционного процесса — стремление уйти от конкуренции с почвообитающими сапротрофами в свободную нишу — живое растение, недоступное, вследствие иммунных свойств живой клетки, для большинства микроорганизмов. Самый простой способ преодолеть клеточный иммунитет — убить клетки хозяина. Ho гибель хозяина означает возврат к конкуренции с почвообитающими организмами. Поэтому эволюция паразитизма — это путь к биотрофии, означающий замену грубого преодоления иммунных свойств живого хозяина — некротрофии, мягкими способами, при которых клетки хозяина остаются длительное время живыми. Это достигается благодаря особенностям метаболизма биотрофных паразитов, отличающим их от некротрофов.
Снижение разнообразия и концентрации токсичных для растения метаболитов, в частности, гидролитических ферментов (табл. 1.2). Например, у возбудителя мучнистой росы ячменя Erysiphe graminis гидролитические ферменты выделяются только из кончика инфекционной гифы и их активность проявляется только на расстоянии 0,1 мкм от гифы.
Отсутствие механического повреждения мембран вследствие апопластного (вне плазмалеммы) развития. Многие фитопатогенные бактерии и некоторые грибы развиваются исключительно в межклетном пространстве, выделяя в среду ферменты, которые разрыхляют клеточные стенки растений и способствуют диффузии питательных веществ в межклеточное пространство. Другие (биотрофные грибы) вызывают локальное растворение клеточных оболочек и через образующееся отверстие проникают в клетку, но, не разрывая плазмалеммы, впячивают ее и образуют расширенную или даже разветвленную структуру — гаусторий (рис. 1.2), окруженный продолжением плазмалеммы — экстра-гаусториальной мембраной. Последняя несколько отличается от нормальной плазмалеммы химическим составом (иначе окрашивается, не имеет интрамембранных включений, стеринов и АТФ-азной активности) и многочисленными инвагинациями, свидетельствующими об активном транспорте веществ через мембрану. Между клеточной стенкой гаустории и экстрагаусториальной мембраной находится экстрагаусториальный матрикс, «нейтральная полоса», через которую осуществляется обмен метаболитами и который защищает партнеров от взаимного отравления токсичными продуктами. Таким образом, наряду с обычной для грибов адсорбцией питательных веществ всей поверхностью мицелия, биотрофы имеют и специальный, трофический орган гаусторий.
Выделение в зараженные ткани растения биологические активных веществ, активизирующих их метаболизм и улучшающих условия жизни паразита. Биотрофные паразиты, в отличие от некротрофных, выделяют в зараженные ткани не столько токсичные для них продукты, сколько вещества гормональной природы, регулирующие метаболизм. Ржавчинные, головневые, тафриновые и другие грибы, многие фитопатогенные бактерии выделяют в растения индолилуксусную кислоту, гибереллины, цитокинины и другие соединения, которые приводят к значительным морфолого-физиологическим изменениям растения-хозяина.
1. Усиливается приток продуктов фотосинтеза в зараженные участки растения. Это показано, например, с помощью радиоавтографии зараженных ржавчиной листьев пшеницы, которая росла в атмосфере радиоактивно меченого углекислого газа (l4CO2). На рис. 1.3 показано, что радиоактивная метка концентрируется в зоне заражения. Один из механизмов усиления транспорта продуктов фотосинтеза в зону заражения — перехват их паразитом и включение в соединения, отсутствующие у растения. Так, первичный продукт фотосинтеза — глюкоза потребляется растением на энергетические процессы и синтезы структурных и запасных продуктов. В клетках гриба глюкоза быстро трансформируется в шестиатомный спирт маннит, дисахарид трегаллозу, вследствие чего содержание глюкозы в зоне заражения резко падает и она транспортируется вдоль градиента концентрации.
2. Это часто сопровождается разрастанием зараженных тканей, формированием опухолей, галлов и т. п. новообразований.
3. Зараженные участки растений стареют медленнее незараженных, дольше сохраняют ювенильное состояние. Функциональная активность ядер в клетках пшеницы, зараженной некротрофом Bipolaris sorokiniana, после короткого периода активизации падает ниже активности ядер в незараженных клетках, а при заражении биотрофом Puccinia triticina растет непрерывно. При заражении гемибиотрофом Septoria nodorum активность ядер занимает промежуточное положение (рис. 1.4). Листья после обрывания желтеют вследствие разрушения хлоропластов. Однако вокруг пустул битрофного возбудителя ржавчины долго сохраняются зеленые островки.
4. Увеличивается общая неспецифическая стойкость протопласта к повреждающим действиям. Известный американский фитопатолог С. Ярвуд, много сделавший для выяснения природы биотрофии, заражал одну половинку листа фасоли биотрофным паразитом (ржавчинными или мучнисторосяными грибами), а вторую оставлял незараженной. Затем весь лист подвергался воздействиям, вызывающим повреждение и гибель клеток (высокие и низкие температуры, ядовитые поллютанты и др.). Во всех случаях зараженные половинки листьев оказывались более стойкими, чем незараженные и погибали при более интенсивных воздействиях. Поскольку причины гибели клеток от разных воздействия также различны, можно сделать вывод об общем повышение стойкости протопластов клеток зараженных растений.
Таким образом, биотрофные паразиты осуществляют ту или иную степень интеграции с хозяйскими клетками. Наибольшая интеграция осуществляется фитопатогенными вирусами, а среди эукариот — паразитическими красными водорослями. Облигатные паразиты составляют более 15 % родов морских красных водорослей. Они имеют мелкие редуцированные бесцветные (утратившие фотосинтетические пигменты) талломы. Большинство видов — адельфопаразиты, паразитирующие на родственных видах водорослей (из одного семейства), некоторые виды (аллопаразиты) специализированы к паразитированию на неродственных видах.
При контакте с клеткой хозяина паразитическая отчленяет мелкую конъюкторную клетку с ядром, которая сохраняет связь с талломом паразита через гликопротеиновую пробку (рис. 1.5). Коньюкторная клетка сливается с хозяйской клеткой и переливает в нее ядро, а у некоторых видов также митохондрии и протопластиды, которые реплицируются в хозяйских клетках и через межклеточные связи переходят в соседние клетки, вытесняя ядра и митохондрии хозяина. После определенного периода паразитического существования талломы некоторых паразитов приобретают пигментацию возможно за счет транспорта в них не только питательных веществ хозяина, но и его пластид. У некоторых видов красных водорослей под влиянием информации, внесенной паразитом, вокруг зараженного места начинается усиленное деление клеток, формирование раковой опухоли.
Геном многих вирусов включает лишь несколько генов, необходимых для синтеза собственных компонентов — белка и нуклеиновой кислоты. Вирусы лишены ферментов энергетического обмена и белоксинтезирующего аппарата. Синтез необходимых ферментных и структурных белков происходит на рибосомах хозяйской клетки с использованием ее энергозапасающих молекул, а в некоторых случаях и ферментов, катализирующих синтез РНК.
Таким образом, облигатный паразитизм может осуществляться па уровне органелл и даже молекул.
Биотрофный способ питания позволяет паразиту длительное время находиться в тканях растения-хозяина. Однако за это приобретение была заплачена дорогая цена: а) потеря антибиотических веществ и снижение активности ферментов, разрушающих полимеры растительного происхождения; б) изменение структуры мембран, вследствие чего биотрофы выделяют в окружающую среду органические соединения; в) высокая «пригнанность» собственного метаболизма к метаболизму хозяина, специализация к поражению только определенных видов растений. Поэтому после гибели хозяина многие биотрофные паразиты не способны возвратиться к сапротрофному питанию, не выдерживают конкуренции с некротрофами и сапротрофа (экологически облигатные паразиты), не могут заражать не родственные своему хозяину растения, а некоторые не способны даже культивироваться на искусственных питательных средах (физиологически облигатные паразиты).
С другой стороны, биотрофный паразитизм, по крайней мере на первой фазе, представляет собой форму симбиотрофизма, ибо паразит находится в живых клетках или тканях хозяина и даже стимулирует их метаболизм. По-видимому, биотрофный паразитизм и симбиоз грибов и бактерий — две ветви эволюции фитопатогенов от некротрофии к биотрофии.
Как видно, тип питания вызывает глубокие изменения в метаболизме и морфогенезе паразитов. Поэтому трофность является важным таксономическим признаков, по которому разделяют виды некоторых грибов и бактерий. Например, среди видов грибов рода Cladosporium есть облигатные сапротрофы, развивающиеся на органических субстратах растительного или животного происхождения, различных материалах и изделиях и даже на жидком топливе; есть очень слабые паразиты, способные заражать отмирающие ткани растений; есть виды с выраженным некротрофным питанием и, наконец, биотрофы (табл. 1.3).
Биотрофы имеют более крупные конидии, чем сапротрофы, отличаются слабой активностью ферментов утилизации аминного азота и деградации углеводных полимеров, высокой чувствительностью к антибиотическим веществам сапротрофных микроорганизмов и, следовательно, низкой конкурентоспособностью с ними. Некротрофы занимают промежуточное положение.
Среди фитофторовых грибов можно также обнаружить сапротрофов, развивающихся на растительных остатках в водоемах и влажной почве (Phytophthora gonapodyides), слабо специализированных некротрофных (Р. cactorum) и высоко специализированных биотрофных (Р. infestans) паразитов.
Также в роде Pseudomonas встречаются сапротрофные виды бактерий, например, P. aeruginosa, которая живет в почве и может вызывать загнивание ран (синегнойная палочка); сапротрофные виды, способные поражать ослабленные или стареющие растения (некоторые штаммы P. fluorescens) и активные биотрофные паразиты (Р. syringae).