Методы диагностики, основанные на взаимодействии антител с антигенами фитопатогенов

9-03-2014, 21:32
Перспективность иммунологических методов для диагностики, а также межвидовой и внутривидовой дифференциации фитопатогенов давно оценена фитопатологами. Сначала эти методы использовались для определения вирусов, вызывающих болезни растений, хотя их также пытались адаптировать для обнаружения и идентификации других фитопатогенов. Достаточно сказать, что первые антисыворотки к грибам были получены еще в 1903 г., а уже в 1937 г. была сделана попытка диагностировать с помощью иммунологической реакции виды и географические формы твердой головни пшеницы. Однако более систематическое использование иммунохимических методов началось в 60-е гг. прошлого столетия в связи с появлением и быстрым развитием иммунодиффузии, иммунофлуоресценции и иммуноэлектрофореза. Результаты первого этапа иммунологической диагностики фитопатогенных микроорганизмов были обобщены Кровэлом в 1961 г. Хотя в то время иммунологические методы в большинстве случаев подтверждали таксономический статус микроорганизмов, установленный с помощью традиционных методов фитопатологии и микробиологии, они позволили также выявить у фитопатогенов внутривидовые отличия, поскольку у патогенов, принадлежащих к одному и тому же виду, были обнаружены различные серотипы. Немного позже для идентификации трудно изолируемых бактерий и грибов была использована иммунофлуоресценция. Например, гриб Polyporus fomentarius был обнаружен в смешанной культуре, почве и инфицированных корнях сосны с помощью флуоресцирующих антител. Стало очевидным, что иммунохимические методы пригодны для обнаружения и диагностики возбудителей в растениях и других природных матрицах (объектах, образцах). К концу 60-х гг. прошлого века эти методы, особенно иммунодиффузия и иммунофлуоресценция, довольно широко использовались в целом ряде прикладных областей для определения важных с практической точки зрения фитопатогенов и уточнения их таксономического положения. В 70-80 гг. XX в. для исследования фитопатогенов стали применять иммуноферментный метод, пришедший на смену радиоиммунологическому анализу. Внедрение данного метода в лабораторную практику значительно расширило возможности фитопатологии в области иммунодиагностики заболеваний растений и их возбудителей.
Все методы иммунодиагностики базируются на способности антител связывать антигены. Задача любого иммунологического теста — обнаружение и (или) количественная характеристика взаимодействия специфичных (диагностических) антител с гомологичными (детектируемыми) антигенами. Эта задача может быть решена разными способами. Комплексы «антиген — антитело» могут быть обнаружены визуально благодаря их способности формировать видимые невооруженным глазом или различимые под микроскопом преципитаты в жидкой среде (агглютинационный тест и иммунопреципитация) или в геле (различные виды иммунодиффузионного теста). Участвующие во взаимодействии антитела могут быть соединены химически с флуоресцентным красителем, а комплекс «антиген — антитело» обнаружен под флуоресцентным микроскопом (методы прямой и непрямой иммунофлуоресценции). Антитела с радиоактивной меткой можно использовать для количественного определения антигена (радиоиммунный метод), а антитела, маркированные коллоидным золотом, — для иммуногистохимических исследований с помощью электронной микроскопии или иммуноблоттинга. Однако, наиболее распространенным способом обнаружения взаимодействия «антиген — антитело» является иммуноферментный анализ (ИФА, Enzyme Immunoassay — EIA), при котором используются антитела, химически связанные с ферментом, а после добавления субстрата в результате ферментативной реакции происходит образование окрашенного продукта.
Успешной разработке диагностических методик, основанных на ИФА, способствовали два фундаментальных открытия. Во-первых, было установлено, что антитела, нековалентно связанные с твердым носителем, и ферменты, ковалентно связанные (конъюгированные) с антителами или антигенами, не утрачивают своей биологической активности, т. е. иммобилизованные антитела продолжают связывать антигены, а связанные ферменты — расщеплять субстраты. Во-вторых, оказалось, что конъюгаты антител с ферментами сохраняют свою активность в растворе. Как антитела, так и их конъюгаты с ферментами обладают высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к антигенам. Они распознают и избирательно связывают тот антиген, против которого они были получены. Каждая молекула антитела несет только одну молекулу фермента, который, однако, катализирует превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата. Это приводит к своеобразному «усилению сигнала» и позволяет зафиксировать наличие гомологичного антигена, даже если он присутствует в очень незначительных количествах.
На сегодняшний день предложены десятки вариантов ИФА, но наиболее широкое распространение в диагностике инфекционных заболеваний получила одна из его разновидностей — гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ (Enzyme Linked Immunosorbent Assay — ELISA). Применению ELISA в фитопатологических исследованиях с целью обнаружения и идентификации возбудителей болезней растений посвящено много хороших обзоров. Некоторые из них можно найти в списке литературы, приведенном в конце главы.
Ряд компаний производят и продают диагностические наборы, оборудование и материалы для ELISA. Для многих фитопатогенных вирусов, бактерий, оомицетов и грибов выпускаются готовые к использованию коммерческие диагностикумы (например, производства компаний Agdia, Elkhart, ADGEN Phytodiagnostic и др.).

  • Анализ состава жирных кислот при идентификации фитопатогенных бактерий
  • Разновидности метода ПЦР
  • Методы с использованием ПЦР
  • Методы гибридизации нуклеиновых кислот
  • Другие методы иммунодиагностики фитопатогенов
  • Быстрые ELISA-тесты
  • Некоторые примеры практического использования ELISA
  • Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии
  • Иммуноферментный сорбционный анализ - ELISA
  • Современные методы диагностики фитопатогенов

  • Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

    Министерство сельского хозяйства Оренбургской области

    Правительство Оренбургской области

    Визитка компании - сайт компании

    Ильинка





    Юг Агро Акцент

     

    • Рейтинг@Mail.ru
    • Яндекс.Метрика
    • Индекс цитирования