Иммуноферментный сорбционный анализ - ELISA

9-03-2014, 21:42
Антитела
Антитела являются ключевым компонентом ELISA, обеспечивающим его чувствительность и специфичность. Антитела (иммуноглобулины или γ-глобулины), которые иммунная система млекопитающих образует в ответ на внедрение чужеродного организма или введение чужеродных макромолекул, представляют собой гликопротеины.
В принципе, для выявления фитопатогенов с помощью ELISA возможно использовать антисыворотку иммунизированного животного (называемую также иммунной сывороткой), которая содержит антитела к их антигенам, но согласно общепринятой практике, предварительно антитела выделяют из антисыворотки, а для приготовления конъюгатов с ферментами обязательно используют выделенные и очищенные антитела. Независимо от того, применяется ли ELISA для качественной или количественной диагностики, он нуждается в высокоспецифичных и чувствительных антителах.
В зависимости от особенностей структуры, антигенных и биологических свойств иммуноглобулины разделяются на несколько классов. Обычно в ELISA используют иммуноглобулины класса G (IgG) или их фрагменты (наиболее часто Fab-фрагмент). Молекула IgG состоит из двух легких и двух тяжелых цепей, соединенных дисульфидными связями (рис. 3.1). Каждая из цепей имеет в своем составе константные (CH1, СН2, СНЗ, CL) и вариабельные (VH и VL) области. Фермент папаин расщепляет молекулу IgG на три фрагмента по месту шарнирной зоны. Два фрагмента, называемые Fab, несут гипервариабельные последовательности, ответственны за связывание с антигенами и контролируют его специфичность. Фрагмент Fe содержит константные области. Поскольку эти фрагменты не утрачивают функции, которые они выполняли, входя в состав молекулы, их, используют в некоторых вариантах ELISA вместо целых антител.
Иммуноферментный сорбционный анализ - ELISA

Основным свойством специфичных антител, в значительной степени определяющим успех ELISA, является их аффинность, которая характеризует прочность связывания активных центров молекулы антитела с распознаваемым и связываемым (детерминантным) сайтом антигена. Аффинность зависит от взаимной пространственной комплементарности антигенсвязывающего центра антитела и антигенной детерминанты (или эпитопа): чем выше их комплементарность, тем выше аффинность.
Для иммунодиагностики фитопатогенов используют антитела, полученные разными способами.
Поликлональные антитела (polyclonal antibodies — pABs). Сыворотки от иммунизированных животных обычно представляют собой смесь сходных, но не идентичных антител, продуцируемых множеством лимфоцитов. Такие антитела принято называть поликлональными. Поэтому антисыворотка, полученная к какому-либо иммуногену (в качестве которого может выступать неочищенный экстракт биомассы фитопатогена или отдельные вещества, специально выделенные из его состава) содержит гетерогенную популяцию антител, способных взаимодействовать с разными детерминантами данного иммуногена.
Поликлональные антитела много и успешно используют для иммунодиагностики фитопатогенных вирусов, бактерий и грибов. Получение поликлональных антител представляет собой относительно простую и не слишком дорогостоящую процедуру, которая может быть выполнена за 3-4 месяца. Кроме того, способность связываться с неидентичными антигенами детерминантами является преимуществом, если диагностируют патоген из природной популяции, в которой антигенная конфигурация может довольно значительно варьировать. В этом случае применение pABs дает шанс «перекрыть» биологическое разнообразие данного патогена. Однако специфичность pABs не всегда оказывается достаточно высокой, что приводит к перекрестному взаимодействию с нецелевыми антигенами (обычно из родственных микроорганизмов или вирусов). Этот недостаток отчасти препятствует практическому применению pABs для обнаружения некоторых вирусов, бактерий и, особенно, грибов. Концентрация целевых pABs в антисыворотке невысока. Доля антител, специфичных к гомологичному антигену, составляет всего 5-10% от общего иммуноглобулина, а их аффинность может изменяться от партии к партии. Одним из способов устранить нежелательные перекрестные реакции с посторонними антигенами является частичная очистка pABs. Ее проводят путем абсорбирования полученной поликлональной антисыворотки гетерологичными антигенами (так называемого истощения) или посредством сильного разбавления высокотитражных антисывороток, чтобы свести к минимуму или удалить перекрестно-реагирующие компоненты и снизить уровень фоновой реакции, сохраняя при этом достаточно высокий уровень специфического взаимодействия. Другой способ повышения специфичности — использование моноклональных антител.
Моноклональные антитела (monoclonal antibodies — mABs) представляют собой популяцию антител с высокой специфичностью к одному эпитопу. Моноклональные антитела образуются гибридомами — гибридными клетками, у которых способность производить высокоспецифичные антитела сочетается со способностью быстро размножаться in vitro. Технология получения mABs и ее принципы подробно изложены во многих доступных учебниках, монографиях, обзорах и методических статьях. В общих чертах она состоит в том, что лимфоциты иммунизированных мышей гибридизируют с культивируемыми в среде опухолевыми клетками этих животных (миелобластами). Затем, в процессе пассажей гибридом отбирают клоны, образующие антитела с нужной специфичностью. Принципиальным отличием моноклональных антител от поликлональных является их стандартная специфичность к определенному эпитопу, которая воспроизводится при пассажах. Чрезвычайно высокий уровень специфичности mABs, позволяет выявлять очень тонкие различия у близкородственных штаммов или серотипов вирусов и микроорганизмов. Моноклональные антитела однородны не только по своей специфичности, но и по другим биологическим и физико-химическим свойствам (авидности, стабильности, аффинности).
В фитопатологии mABs прежде всего стали применять для иммунодиагностики вирусов. Сейчас их используют также в ELISA других фитопатогенов — бактерий, фибов, фитоплазм и оомицетов. Например, с помощью mABs в составе зооспор и цист фитопатогенных оомицетов удалось обнаружить как общие, так и отличные антигены. Во многих случаях дифференциация вирусных штаммов, бактериальных серотипов, а также рас и изолятов грибов с помощью mABs оказывается более успешной, чем при участии pABs. В то же время требуется известная осмотрительность при использовании mABs с целью обнаружения и идентификации фитопатогенов. Из-за своей высокой специфичности эти антитела могут не распознать тот или иной природный штамм или изолят, если в результате мутации строение эпитопа, к которому специфичны данные антитела, изменилось. С другой стороны, при наличии общих антигенов, как это, например, имеет место у разных серотипов вируса желтой карликовости ячменя, mABs оказываются недостаточно специфичными.
Гибридомная технология делает возможным получение любых количеств mABs к разнообразным антигенам. Это, в свою очередь, позволяет производить коммерческие диагностические препараты для обнаружения, идентификации фитопатогенов и количественной оценки зараженности растений с помощью ELISA.
Антитела, экспонированные на поверхности фага (метод phage displayed antibodies). На основе достижений молекулярной биологии и генной инженерии была разработана новая технология производства антител, при которой нет необходимости иммунизировать животных и получать антисыворотки. Амплифицированные фрагменты иммуноглобулинов, содержащие вариабельные домены с гипервариабельными последовательностями, ответственными за специфичность антител, встраиваются в оболочечный белок на поверхности бактериофага. Данная технология позволяет создавать библиотеки функциональных фрагментов антител различных животных. Это дает практически неофаниченный ресурс для получения антител к большому числу самых разных антигенов, так как из библиотек, представленных на поверхности фага, почти всегда можно подобрать фрагмент с нужной специфичностью или найти подходящие специфичности для создания рекомбинантного антитела. Описаны примеры использования этой техники для диагностики поражающих растения вирусов, бактерий и грибов.
Антигены
Антигенами являются молекулы чужеродных организмов, против которых образуются антитела. Биологические макромолекулы (например, протеины, гликопротеины, липополисахариды) являются антигенами, обладающими иммуногенными свойствами, т. е. при попадании в организм млекопитающих в изолированном виде или в составе клеточных структур эти соединения способны самостоятельно индуцировать образование антител. Помимо этих веществ антигеном может быть почти любое полимерное соединение, имеющее функциональные группы, которые могут быть распознаны антителами. Участки иммуногенных макромолекул (например, 6-10 аминокислотных остатков в молекуле белка), или функциональные группы других иммуногенов, определяющие специфичность вырабатываемых к ним антител, называются антигенными детерминантами. Если у одной молекулы антигена имеется несколько детерминант, он считается поливилентным. Гаптены — это небольшие органические молекулы и пептиды, которые не являются иммуногенными, но будучи ковалентно связанными с белковой молекулой становятся антигенными детерминантами. Образующиеся в ответ антитела способны связывать как конъюгаты гаптенов с белком, так и свободные гаптены.
Для получения антител к фитопатогенам могут быть использованы разнообразные иммуногенные антигены растительных вирусов и микроорганизмов, с другой стороны, самые разные структуры и метаболиты данных возбудителей могут являться определяемыми антигенами. Если лабораторным животным вводят вирусы, целые клетки, клеточные стенки, растворимые или солюбилизированные высокомолекулярные антигены, экстрацеллюлярные секреты, экстракты из грибов или бактерий, то в результате получают антисыворотки с поликлональными антителами. Нет прямых указаний на то, использование какого именно типа иммуногена способствует повышению специфичности антисыворотки. В целом, введение очищенных антигенов приводит к синтезу более специфичных антител. Поэтому, если возможно, для иммунизации всегда лучше использовать высокоочищенные антигены с известными пространственными и химическими структурами.
Конъюгаты и субстраты
В иммуноферментном анализе ферментную метку вводят в молекулу антитела или антигена. В ELlSA детектирующими молекулами являются конъюгаты антител с ферментами. Для приготовления конъюгатов наиболее часто используют пероксидазу хрена (ПХ; horseradish peroxidase — HRPO) или щелочную фосфатазу (alkaline phosphatase — АР). Ковалентное связывание этих ферментов с иммуноглобулинами осуществляют с помощью глютаральдегида, если используют щелочную фосфатазу, или периодатного окисления в случае ПХ. Присоединение щелочной фосфатазы к антителу глютаральдегидом происходит в одну стадию. Пероксидазные конъюгаты получают окисляя фермент перйодатом натрия. Альдегидные группы углеводного участка ПХ, образовавшиеся в результате этой реакции, реагируют с аминокислотными остатками иммуноглобулинов.
Субстратами для пероксидазных конъюгатов служат о-фенилендиамин и перекись водорода. Окрашенный продукт реакции имеет максимум поглощения при 492 нм. Субстратом щелочной фосфатазы является р-нитрофенилфосфат, он превращается р-нитрофенол, который измеряют при 405 нм.
Помимо конъюгатов с пероксидазой хрена и щелочной фосфатазой для диагностики фитопатогенов получают конъюгаты и с другими ферментами. Например, для обнаружения вирусов растений применяют конъюгаты с неорганической пирофосфатазой и пенициллиназой.
При детекции патогенов в растительных тканях предпочтительнее использовать конъюгаты антител со щелочной фосфатазой, так как данный фермент, в отличие от пероксидазы, не встречается в высших растениях. Это позволяет снизить вероятность получения ложноположительных результатов при анализе растительного сока или экстракта. Тем не менее, анализ патогенов в растительных образцах очень часто проводят с помощью антител, меченных ПХ, поскольку данный фермент отличается высокой удельной активностью, стабильностью и небольшим размером (отсутствуют пространственные ограничения при конъюгировании с антителом). Важной характеристикой конъюгатов антител с ПХ является показатель RZ (Reinheitszahl), который рассчитывают, определяя отношение поглощения конъюгата при 403 нм к его поглощению при 278 нм. В конечном счете, RZ показывает, какая доля антител, подвергшихся конъюгированию, действительно несет ферментную метку. У конъюгатов с достаточным содержанием меченых антител этот показатель должен составлять 0,3-0,4. Обычно, готовые для анализов конъюгаты после добавления равного объема глицерина хранят при -20 °С.
Чувствительность ELISA можно сделать еще более высокой, используя систему «стрептавидин—биотин» (или «авидин—биотин») или конъюгаты с люциферазой и флуоресцирующий субстрат люциферин (люминесцентный или флуоресцентный ELISA). Диагностические возможности ELISA значительно возросли после разработки его мультиплексного варианта. Мультиплексный (множественный, или сложный) анализ (multiple assay) применяют, когда в образце, внесенном в одну лунку планшета, необходимо одновременно обнаружить несколько видов фитопатогенов.
Твердые фазы
Чаще всего для осуществления ELISA применяют полистирольные 96-луночные планшеты, так как полистирол легко адсорбирует антитела и различные антигены. К тому же в распоряжении исследователей имеется целый ряд химических методов обработки планшетов, в результате которых на их поверхности остаются реакционно-способные функциональные группы (например, гидразин или имид малеиновой кислоты), способные ковалентно связывать антитела и антигены. Для того, чтобы усилить способность полистирола абсорбировать антитела и другие белки, лунки обрабатывают 1 % нитроцеллюлозой. Дополнительным эффектом такой обработки является более равномерная абсорбция молекул. Все эти процедуры специальной подготовки планшетов из полистирола повышают эффективность ELISA. В качестве твердой фазы в одном из вариантов ИФА, так называемом дот-ELISA, для иммобилизации как антигенов, так и антител используют нитроцеллюлозные мембраны. В этом случае предпочтительнее использовать субстраты, в результате расщепления которых на мембране образуется нерастворимый продукт ферментативной реакции. Твердыми носителями также могут служить магнитные шарики или частицы, покрытые полистиролом. Применение мембран или магнитных частиц обычно упрощает и ускоряет процедуру анализа, делая его более пригодным для полевых условий.

  • Анализ состава жирных кислот при идентификации фитопатогенных бактерий
  • Количественная обработка результатов ПЦР
  • Разновидности метода ПЦР
  • Методы гибридизации нуклеиновых кислот
  • Другие методы иммунодиагностики фитопатогенов
  • Быстрые ELISA-тесты
  • Некоторые примеры практического использования ELISA
  • Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии
  • Методы диагностики, основанные на взаимодействии антител с антигенами фитоп ...
  • Современные методы диагностики фитопатогенов

  • Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

    Министерство сельского хозяйства Оренбургской области

    Правительство Оренбургской области

    Визитка компании - сайт компании

    Ильинка





    Юг Агро Акцент

     

    • Рейтинг@Mail.ru
    • Яндекс.Метрика
    • Индекс цитирования