Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии

Теоретические аспекты иммуноферментного анализа, в частности, его физико-химические основы, а также принципы классификации его различных модификаций подробно изложены в ряде руководств, в частности в книге «Теория и практика иммуноферментного анализа». В данном разделе мы лишь вкратце воспроизведем классификацию ИФА и рассмотрим как вариант данного метода твердофазный иммуноферментный анализ — ELISA, который получил наибольшее признание в диагностической фитопатологии.
Ta или иная разновидность ИФА может быть отнесена к гомогенным или гетерогенным, в зависимости от того, где происходит специфическое взаимодействие «антиген — антитело». При гомогенном анализе, все стадии, включая ферментативную реакцию, происходят в растворе. Детекция антигенов или их количественное измерение проводится без разделения взаимодействующих и невзаимодействующих компонентов иммунологической реакции. Гетерогенный вариант анализа предполагает разделение свободного и иммунохимически связанного иммунореагента (антигена, антитела) на твердой фазе с помощью иммобилизованных на ней комплементарных реагентов (соответственно, антитела и антигена). Одновременно не связавшиеся антитела, антигены или конъюгаты, а также возможные ингибиторы реакции и другие вещества, присутствие которых нежелательно, удаляются из реакционной системы отмыванием. Гомогенный анализ обычно используют для низкомолекулярных соединений, например, для обнаружения и определения количества таких гаптенов, как токсины, гормоны, лекарственные вещества и т. п. Сфера его применения для диагностических целей в фитопатологии, по сравнению с гетерогенным вариантом, довольно ограничена. Детекцию по гаптенам осуществляют, например, в ELISA микотоксинов. При получении антисывороток со специфичностью к микотоксинам обычно синтезируют два конъюгата с двумя различными белками, затем один из них используют для иммунизации, а конъюгат со вторым белком — непосредственно при анализе. Это позволяет избежать абсорбции антисыворотки первым белком, которая, в противном случае, будет нужна, чтобы убрать антитела со специфичностью к его детерминантам.
Среди вариантов ELISA различают конкурентные и неконкурентные. Отличительными чертами конкурентного варианта является одновременное присутствие на первой стадии анализа антигена из анализируемого образца и меченого антигена, а также их конкуренция за соединение с ограниченным числом сайтов связывания на антителах. Конкурентный ELISA применяется для диагностики фитопатогенов, но не является широко распространенным, поскольку в качестве иммуногенов в фитопатологии часто используют не индивидуальные антигены, в которые можно ввести метку, а их смеси или просто экстракты. ELISA называют прямым или непрямым в зависимости от типа антитела, маркированного ферментом. В прямом варианте метода определяемый антиген обнаруживают конъюгатом гомологичных (полученных к данному антигену и специфичных к нему) антител. В непрямом ELISA для связывания целевого антигена используют немеченые гомологичные антитела (ABs1), а затем образовавшийся комплекс «антиген — антитело» детектирую с помощью ферментных конъюгатов других (вторичных, или антивидовых) антител, которые получены против ABs1. Наконец, различают варианты ELISA в зависимости от типа фермента и субстрата (колориметрический, флуориметрический, биолюминесцентный ELISA) или от способа измерения ферментативной активности. Разнообразие модификаций ELISA — главным образом результат комбинаций основных, описанных выше, вариантов, а также того, какой из иммунореагентов (антиген или антитело) иммобилизуют на твердой фазе.
Основные области использования ELISA в фитопатологии — детекция и количественное определение патогенов в растениях, почве или других образцах, выявление инфицированных растений до появления симптомов заболевания, а так же отбор здоровых семян или посевного материала. Весьма распространенным вариантом анализа в этих областях является сэндвич-ELISA, в котором на твердой фазе иммобилизуют антитела (Double Antibody Sandwich-ELISA — DAS-ELISA).
По существу, сэндвич-вариант (рис. 3.2) с использованием полистирольных планшетов представляет собой последовательность следующих процедур:
1. Внесение антител специфичных к фитопатогену в лунки планшета.
2. Инкубация планшета, во время которой антитела абсорбируются на полистироле, с последующей промывкой, которая удаляет несорбированные антитела.
3. Внесение в лунки раствора какого-либо белка, не вступающего в реакцию с иммунореагентами и ферментом, чтобы блокировать участки неспецифического связывания на полистироле.
4. Добавление образца, из которого иммобилизованные антитела захватывают и связывают определяемый антиген (антигены).
5. Инкубация планшета, во время которой происходит взаимодействие этих иммунореагентов, и его отмывка, чтобы удалить неспецифичные компоненты.
6. Добавление специфичных для определяемого фитопатогена антител меченых или не меченых ферментом.
Если на этой стадии используют антитела с ферментной меткой (конъюгаты), то далее следуют стадия 7. Если на стадии 6 в реакцию вводят немеченые антиген-специфичные антитела, проводится дополнительная стадия 6а.
6а. Добавление конъюгатов антивидовых антител (например, если антитела, специфичные к фитопатогену, были получены из антисыворотки иммунизированных кроликов, добавляют меченые ферментом антитела мыши против иммуноглобулинов кролика).
7. Инкубация планшета и промывание, чтобы удалить несвязавшийся конъюгат.
8. Добавление субстрата фермента с последующей кратковременной или более длительной инкубацией, во время которой развивается окрашивание. Торможение ферментативной реакции.
9. Регистрация результатов анализа визуально или измерение поглощения инструментально.

Фактически, приведенный выше протокол объединяет два общепринятых формата ELISA, хорошо известные как прямой и непрямой сэндвич-ELISA. Непрямой сэндвич-вариант часто встречается в литературе под названием TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich-ELISA). Как уже отмечалось, в нем используют антитела двух различных видов животных. Антитела, специфичные к целевому антигену, получают от одного вида, а конъюгаты синтезируют с антителами, выделенными из антисыворотки другого вида против константных детерминант иммуноглобулинов (IgG) животных первого вида. Вместо вторичных (антивидовых) конъюгатов часто можно использовать конъюгаты ферментов с имеющим сродство к иммуноглобулинам белком А из стафилококка. При необходимости, в непрямом ELISA может быть использована иммунная сыворотка одного и того же животного. В этом случае анализируемый антиген улавливается иммобилизованным на твердой фазе Fab-фрагментом, на которым локализован сайт связывания с антигеном. После этого связанный антиген покрывают целыми гомологичными антителами, а затем полученный «сэндвич» детектируют конъюгатом с антителами, полученными против Fe фрагмента.
Несмотря на то, что DAS-ELISA может быть использован для анализа только поливалентных антигенов, которые имеют, по крайней мере, две детерминанты; а также состоит из нескольких стадий и в связи с этим требует довольно много времени, он обладает рядом достоинств. Среди них решающим является высокая чувствительность, превосходящая возможности других вариантов ELISA. Если принять, что максимальная константа равновесия взаимодействия «антиген — антитело» составляет 10в12*M-1, то, теоретически, предельная чувствительность DAS-ELISA могла бы достигать 10в-14M. Достоинством TAS-ELISА является универсальность антивидового конъюгата, который может быть применен для анализа различных антигенов.
Как следует из описанной выше методики, уровень ферментативной реакции в DAS-ELISA и TAS-ELISA пропорционален количеству антигена, связанного иммобилизованными антителами. Соответственно, уровень поглощения прямо пропорционален количеству анализируемого антигена в образце.
Методика проведения DAS-ELISA может быть упрощена посредством добавления к сорбированным на твердой фазе антителам смеси детектируемого антигена (образца) и конъюгата специфических антител, после кратковременного их инкубирования друг с другом в растворе. Это так называемый двустадийный сэндвич-анализ (two-step DAS-ELISA), при котором часть иммунного комплекса между антигеном и конъюгатом антител может формироваться в гомогенных условиях и удаляться при последующей промывке. Следовательно, чем выше концентрация антигена в образце, тем меньше молекул конъюгата будет реагировать с антигеном, захваченном иммобилизованными антителами. Поэтому уровень поглощения будет обратно пропорционален количеству антигена в анализируемой пробе.
Другим вариантом ELISA является DAC (Direct Antigen Coating) анализ, который также называют PTA-ELISA (Plate-Trapped Antigen ELISA). В отличие от DAS-ELISA, в этом варианте иммуноферментного анализа на твердой фазе абсорбируют не антитела, а антигены. Вообще говоря, DAC-ELISA преимущественно используют при исследовании иммунного ответа на конкретный антиген. Он не столь широко применяется для обнаружения и идентификации фитопатогенов, поскольку далеко не всегда анализируют очищенные антигены с известной структурой и свойствами. Если же такой вариант анализа применим, то следует иметь в виду, некоторые особенности абсорбции разных антигенов. Так, полистирол сорбирует разные белки в зависимости от их концентрации, но он довольно плохо удерживает пептиды, состоящие из 15-20 аминокислотных остатков. Суспензии бактерий и вирусов, имеющие белковые молекулы на своей поверхности, могут быть непосредственно нанесены в лунки с хорошим результатом, но углеводы и гликопротеины с большим содержанием углеводов слабо связываются с полистиролом.
Отметим, что оба описанных здесь варианта ELISA (DAS и DAC) относятся к неконкурентному ИФА, но могут быть трансформированы в конкурентный формат.