Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии

9-03-2014, 21:46
Теоретические аспекты иммуноферментного анализа, в частности, его физико-химические основы, а также принципы классификации его различных модификаций подробно изложены в ряде руководств, в частности в книге «Теория и практика иммуноферментного анализа». В данном разделе мы лишь вкратце воспроизведем классификацию ИФА и рассмотрим как вариант данного метода твердофазный иммуноферментный анализ — ELISA, который получил наибольшее признание в диагностической фитопатологии.
Ta или иная разновидность ИФА может быть отнесена к гомогенным или гетерогенным, в зависимости от того, где происходит специфическое взаимодействие «антиген — антитело». При гомогенном анализе, все стадии, включая ферментативную реакцию, происходят в растворе. Детекция антигенов или их количественное измерение проводится без разделения взаимодействующих и невзаимодействующих компонентов иммунологической реакции. Гетерогенный вариант анализа предполагает разделение свободного и иммунохимически связанного иммунореагента (антигена, антитела) на твердой фазе с помощью иммобилизованных на ней комплементарных реагентов (соответственно, антитела и антигена). Одновременно не связавшиеся антитела, антигены или конъюгаты, а также возможные ингибиторы реакции и другие вещества, присутствие которых нежелательно, удаляются из реакционной системы отмыванием. Гомогенный анализ обычно используют для низкомолекулярных соединений, например, для обнаружения и определения количества таких гаптенов, как токсины, гормоны, лекарственные вещества и т. п. Сфера его применения для диагностических целей в фитопатологии, по сравнению с гетерогенным вариантом, довольно ограничена. Детекцию по гаптенам осуществляют, например, в ELISA микотоксинов. При получении антисывороток со специфичностью к микотоксинам обычно синтезируют два конъюгата с двумя различными белками, затем один из них используют для иммунизации, а конъюгат со вторым белком — непосредственно при анализе. Это позволяет избежать абсорбции антисыворотки первым белком, которая, в противном случае, будет нужна, чтобы убрать антитела со специфичностью к его детерминантам.
Среди вариантов ELISA различают конкурентные и неконкурентные. Отличительными чертами конкурентного варианта является одновременное присутствие на первой стадии анализа антигена из анализируемого образца и меченого антигена, а также их конкуренция за соединение с ограниченным числом сайтов связывания на антителах. Конкурентный ELISA применяется для диагностики фитопатогенов, но не является широко распространенным, поскольку в качестве иммуногенов в фитопатологии часто используют не индивидуальные антигены, в которые можно ввести метку, а их смеси или просто экстракты. ELISA называют прямым или непрямым в зависимости от типа антитела, маркированного ферментом. В прямом варианте метода определяемый антиген обнаруживают конъюгатом гомологичных (полученных к данному антигену и специфичных к нему) антител. В непрямом ELISA для связывания целевого антигена используют немеченые гомологичные антитела (ABs1), а затем образовавшийся комплекс «антиген — антитело» детектирую с помощью ферментных конъюгатов других (вторичных, или антивидовых) антител, которые получены против ABs1. Наконец, различают варианты ELISA в зависимости от типа фермента и субстрата (колориметрический, флуориметрический, биолюминесцентный ELISA) или от способа измерения ферментативной активности. Разнообразие модификаций ELISA — главным образом результат комбинаций основных, описанных выше, вариантов, а также того, какой из иммунореагентов (антиген или антитело) иммобилизуют на твердой фазе.
Основные области использования ELISA в фитопатологии — детекция и количественное определение патогенов в растениях, почве или других образцах, выявление инфицированных растений до появления симптомов заболевания, а так же отбор здоровых семян или посевного материала. Весьма распространенным вариантом анализа в этих областях является сэндвич-ELISA, в котором на твердой фазе иммобилизуют антитела (Double Antibody Sandwich-ELISA — DAS-ELISA).
По существу, сэндвич-вариант (рис. 3.2) с использованием полистирольных планшетов представляет собой последовательность следующих процедур:
1. Внесение антител специфичных к фитопатогену в лунки планшета.
2. Инкубация планшета, во время которой антитела абсорбируются на полистироле, с последующей промывкой, которая удаляет несорбированные антитела.
3. Внесение в лунки раствора какого-либо белка, не вступающего в реакцию с иммунореагентами и ферментом, чтобы блокировать участки неспецифического связывания на полистироле.
4. Добавление образца, из которого иммобилизованные антитела захватывают и связывают определяемый антиген (антигены).
5. Инкубация планшета, во время которой происходит взаимодействие этих иммунореагентов, и его отмывка, чтобы удалить неспецифичные компоненты.
6. Добавление специфичных для определяемого фитопатогена антител меченых или не меченых ферментом.
Если на этой стадии используют антитела с ферментной меткой (конъюгаты), то далее следуют стадия 7. Если на стадии 6 в реакцию вводят немеченые антиген-специфичные антитела, проводится дополнительная стадия 6а.
6а. Добавление конъюгатов антивидовых антител (например, если антитела, специфичные к фитопатогену, были получены из антисыворотки иммунизированных кроликов, добавляют меченые ферментом антитела мыши против иммуноглобулинов кролика).
7. Инкубация планшета и промывание, чтобы удалить несвязавшийся конъюгат.
8. Добавление субстрата фермента с последующей кратковременной или более длительной инкубацией, во время которой развивается окрашивание. Торможение ферментативной реакции.
9. Регистрация результатов анализа визуально или измерение поглощения инструментально.
Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии

Фактически, приведенный выше протокол объединяет два общепринятых формата ELISA, хорошо известные как прямой и непрямой сэндвич-ELISA. Непрямой сэндвич-вариант часто встречается в литературе под названием TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich-ELISA). Как уже отмечалось, в нем используют антитела двух различных видов животных. Антитела, специфичные к целевому антигену, получают от одного вида, а конъюгаты синтезируют с антителами, выделенными из антисыворотки другого вида против константных детерминант иммуноглобулинов (IgG) животных первого вида. Вместо вторичных (антивидовых) конъюгатов часто можно использовать конъюгаты ферментов с имеющим сродство к иммуноглобулинам белком А из стафилококка. При необходимости, в непрямом ELISA может быть использована иммунная сыворотка одного и того же животного. В этом случае анализируемый антиген улавливается иммобилизованным на твердой фазе Fab-фрагментом, на которым локализован сайт связывания с антигеном. После этого связанный антиген покрывают целыми гомологичными антителами, а затем полученный «сэндвич» детектируют конъюгатом с антителами, полученными против Fe фрагмента.
Несмотря на то, что DAS-ELISA может быть использован для анализа только поливалентных антигенов, которые имеют, по крайней мере, две детерминанты; а также состоит из нескольких стадий и в связи с этим требует довольно много времени, он обладает рядом достоинств. Среди них решающим является высокая чувствительность, превосходящая возможности других вариантов ELISA. Если принять, что максимальная константа равновесия взаимодействия «антиген — антитело» составляет 10в12*M-1, то, теоретически, предельная чувствительность DAS-ELISA могла бы достигать 10в-14M. Достоинством TAS-ELISА является универсальность антивидового конъюгата, который может быть применен для анализа различных антигенов.
Как следует из описанной выше методики, уровень ферментативной реакции в DAS-ELISA и TAS-ELISA пропорционален количеству антигена, связанного иммобилизованными антителами. Соответственно, уровень поглощения прямо пропорционален количеству анализируемого антигена в образце.
Методика проведения DAS-ELISA может быть упрощена посредством добавления к сорбированным на твердой фазе антителам смеси детектируемого антигена (образца) и конъюгата специфических антител, после кратковременного их инкубирования друг с другом в растворе. Это так называемый двустадийный сэндвич-анализ (two-step DAS-ELISA), при котором часть иммунного комплекса между антигеном и конъюгатом антител может формироваться в гомогенных условиях и удаляться при последующей промывке. Следовательно, чем выше концентрация антигена в образце, тем меньше молекул конъюгата будет реагировать с антигеном, захваченном иммобилизованными антителами. Поэтому уровень поглощения будет обратно пропорционален количеству антигена в анализируемой пробе.
Другим вариантом ELISA является DAC (Direct Antigen Coating) анализ, который также называют PTA-ELISA (Plate-Trapped Antigen ELISA). В отличие от DAS-ELISA, в этом варианте иммуноферментного анализа на твердой фазе абсорбируют не антитела, а антигены. Вообще говоря, DAC-ELISA преимущественно используют при исследовании иммунного ответа на конкретный антиген. Он не столь широко применяется для обнаружения и идентификации фитопатогенов, поскольку далеко не всегда анализируют очищенные антигены с известной структурой и свойствами. Если же такой вариант анализа применим, то следует иметь в виду, некоторые особенности абсорбции разных антигенов. Так, полистирол сорбирует разные белки в зависимости от их концентрации, но он довольно плохо удерживает пептиды, состоящие из 15-20 аминокислотных остатков. Суспензии бактерий и вирусов, имеющие белковые молекулы на своей поверхности, могут быть непосредственно нанесены в лунки с хорошим результатом, но углеводы и гликопротеины с большим содержанием углеводов слабо связываются с полистиролом.
Отметим, что оба описанных здесь варианта ELISA (DAS и DAC) относятся к неконкурентному ИФА, но могут быть трансформированы в конкурентный формат.

  • Анализ состава жирных кислот при идентификации фитопатогенных бактерий
  • Количественная обработка результатов ПЦР
  • Разновидности метода ПЦР
  • Методы с использованием ПЦР
  • Методы гибридизации нуклеиновых кислот
  • Другие методы иммунодиагностики фитопатогенов
  • Быстрые ELISA-тесты
  • Некоторые примеры практического использования ELISA
  • Иммуноферментный сорбционный анализ - ELISA
  • Методы диагностики, основанные на взаимодействии антител с антигенами фитоп ...

  • Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

    Министерство сельского хозяйства Оренбургской области

    Правительство Оренбургской области

    Визитка компании - сайт компании

    Ильинка Фаворит Агромир Техноорь

    Системы точного земледелия Автопартнер





    Акцент

     

    • Рейтинг@Mail.ru
    • Яндекс.Метрика
    • Индекс цитирования