Методы гибридизации нуклеиновых кислот

9-03-2014, 21:58
Первые сообщения о прикладных исследованиях, в которых использовали гибридизацию нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-овым или РНК-овым зондами, появились в середине 70-х гг. XX в. В 80-х гг. был разработан дот-блот анализ, в котором иммобилизованная ДНК гибридизуется с меченным зондом. Появление нового метода открыло новые возможности для детекции фитопатогенов.
Согласно этому методу ДНК тестируемого образца сорбируют на нитроцеллюлозной (реже на нейлоновой) мембране. Чтобы разделить цепи двуцепочечной молекулы ДНК, мембрану с иммобилизованной ДНК обрабатывают щелочью или нагревают. Сайты связывания на мембране, оставшиеся свободными, блокируют с помощью ДНК других организмов (например, из спермы лосося) или белком (например, бычьим сывороточным альбумином или сухим обезжиренным молоком). Затем, мембрану при определенных температуре (обычно при 65 °С) и концентрации солей инкубируют в растворе, содержащим зонд. Этот зонд представляет собой небольшие одноцепочечные ДНК или РНК, несущие радиоактивную или нерадиоактивную метку. Если анализируемая ДНК содержит комплементарные последовательности, зонд связывается с ней. Чем больше количество последовательностей, комплементарных зонду присутствует в тестируемой ДНК, тем выше степень связывания зонда. He связавшиеся молекулы зонда удаляются отмыванием.
Результаты гибридизации могут быть обнаружены различными способами, которые определяются типом метки, ковалентно связанной с зондом (так называемой молекулы-репортера). Сначала в качестве метки использовали изотоп фосфора (Р32), а результаты обнаруживали методом авторадиографии по затемнению рентгеновской пленки. Радиоактивность метки была причиной весьма ограниченного применения метода гибридизации в области прикладной диагностики болезней растений. Однако очень быстро на смену введения радиоактивной метки пришла методика биотинилирования зонда. После гибридизации с таким зондом мембрана контактирует сначала со стрептовидином (или авидином), конъюгированным с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой, а затем — субстратом. В месте положительной пробы образуется окрашенный продукт ферментативной реакции. Кроме этого, применяют хемилюминесцентные или флуоресцентные зонды, свечение которых фиксируют на рентгеновской пленке. О зондах, меченых флуорогенными молекулами, будет сказано ниже.
Процесс проведения гибридизационного анализа, особенно в том случае, когда зонд несет ферментную метку, очень похож на процедуру дот-ELISA, но следует отметить, что два этих метода основаны на принципиально различном взаимодействии. В ELISA антигены связываются молекулами специфичных к ним антител, в то время как гибридизация является результатом отжига комплементарных цепей нуклеиновых кислот.
Последовательности, используемые в качестве зондов, могут быть получены из нуклеиновых кислот организмов и вирусов или синтезированы химически. Синтетические зонды — это короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, обычно содержащие 20—40 оснований. Синтетические олигонуклеотиды, особенно в комбинации с ПЦР, занимают важное место в диагностике фитопатогенов, так как с их помощью разрабатывают расо- и шамм-специфические тесты для детекции дифференциации близкородственных рас или штаммов, а также относительно менее специфичные тесты, позволяющие определить принадлежность патогена к определенному таксону. Возможности точной видовой и внутривидовой идентификации возбудителей, а следовательно и надежность определения заболевания с помощью олигонуклеотидных зондов, возрастают по мере того, как увеличивается число секвенированных геномов фитопатогенных микроорганизмов и вирусов. Однако, диагностика, основанная на гибридизации нуклеиновых кислот с зондами, имеет ряд ограничений в отношении чувствительности, кроме того, она требует довольно много времени и усилий. Ее чувствительность сравнима с ELISA. Для ее проведения необходимо располагать достаточным количеством ДНК, т. е. нужно, чтобы образец содержал довольно много пропагул патогена (например, по крайней мере 10 000 бактериальных клеток). Процесс гибридизации невозможно полностью автоматизировать.

  • Анализ состава жирных кислот при идентификации фитопатогенных бактерий
  • Количественная обработка результатов ПЦР
  • Разновидности метода ПЦР
  • Методы с использованием ПЦР
  • Другие методы иммунодиагностики фитопатогенов
  • Быстрые ELISA-тесты
  • Некоторые примеры практического использования ELISA
  • Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии
  • Иммуноферментный сорбционный анализ - ELISA
  • Методы диагностики, основанные на взаимодействии антител с антигенами фитоп ...

  • Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

    Министерство сельского хозяйства Оренбургской области

    Правительство Оренбургской области

    Визитка компании - сайт компании

    Ильинка







    Акцент

     

    • Рейтинг@Mail.ru
    • Яндекс.Метрика
    • Индекс цитирования