Методы с использованием ПЦР

9-03-2014, 22:01
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) был предложении в 1983 г. Кэри Мюллисом. Первое сообщение о практическом применении метода появилось в 1985, после чего количество подобных сообщений стало нарастать поистине лавинообразно. В настоящее время опубликовано огромное количество работ, где ПЦР применяют как метод фундаментальных и прикладных исследований для различных целей в самых разных сферах биологической науки. Хотя для диагностики микроорганизмов ПЦР в первую очередь была использована в медицинской микробиологии, она очень быстро заняла лидирующее место среди других методов детекции и идентификации фитопатогенов. Ведущее место, которое метод ПЦР занимает в решении диагностических задач, обусловлено тем, что он позволяет обнаруживать и многократно воспроизводить (амплифицировать) in vitro определенные последовательности ДНК, присутствующие в следовых количествах среди огромного числа других полинуклеотидов. Это обеспечивает чрезвычайно высокий уровень чувствительности при обнаружении и идентификации целевого фитопатогена в составе сложных биологических матриц или объектов окружающей среды.
Метод ПЦР основан на происходящем в природе процессе репликации ДНК, включающей в себя раскручивание двойной спирали ДНК, разделение ее цепей, и комплементарное достраивание каждой из них ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. Механизм ПЦР хорошо изучен и подробно описан. При проведении реакции в тест-пробирке образец ДНК, в присутствии коротких олигонуклеотидов, называемых праймерами, подвергают воздействию определенной температуры, при которой происходит плавление двойной спирали. Праймеры служат в качестве «затравки» для синтеза выбранного фрагмента ДНК. Они комплементарны последовательностям 5'- и 3'-концов фрагмента (прямой и обратный праймеры) и ориентированы таким образом, чтобы обеспечить достраивание новой ДНК цепи. После связывания праймеров с комплементарными последовательностями нуклеотидов (отжига), фермент Таq-полимераза наращивает вторую цепь специфического фрагмента ДНК. Taq-полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из термофильной бактерии Thermus aquaticus, с оптимумом ферментативной активности при 10-12°С. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых и новых цепей в каждом следующем цикле амплификации, т. е. происходит цепная реакция. Число копий возрастает в геометрической прогрессии, и после 25 циклов амплификации (от 30 секунд до нескольких минут каждый) образуется около 100 копий фрагмента. В автоматическом термоциклере в течение 2-3 часов происходит множество циклов, генерирующих более миллиона копий определяемого фрагмента ДНК. Это приводит к образованию такого количества ДНК, которое достаточно для визуальной регистрации результатов ПЦР с помощью электрофореза.
В ПЦР-анализе могут быть выделены три основные стадии: приготовление образца (пробоподготовка), собственно ПЦР и детекция продукта реакции (амплифицированного фрагмента ДНК). Реакционная смесь состоит из следующих основных компонентов: (1) ДНК с фрагментом, который необходимо амплифицировать; (2) пара праймеров; (3) Taq-полимераза; и (4) четыре типа дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) для построения комплементарной цепи в амплифицируемом сайте. Кроме того, в реакционной среде должны присутствовать ионы Mg2+.
Детекция синтезированного продукта полимеразной реакции (ампликона) может быть проведена различными способами. Один из типичных способов — электрофоретическое разделение в агарозном или полиакриламидном геле с последующей визуализацией ампликона интеркалирующими флуоресцентными красителями, такими как бромистый этидий. Наряду с бромистым этидием, ПЦР продукты в геле могут быть окрашены серебром. Иногда необходимо разделение в полиакриламидном геле. Перед электрофорезом амплифицированная ДНК может быть обработана эндонуклеазами рестрикции для изучения полиморфизма длины фрагментов рестрикции амплифицированного продукта. Также применяется детекция амплифицированного фрагмента ДНК посредством гибридизации с зондами, несущими различные метки. К примеру, возможно измерение флуоресценции олигонуклеотидного зонда (прямо или косвенно) после гибридизации его с продуктами реакции в жидкой фазе, или на специальной подложке.
Методы детекции с использованием микротитровальных плашек, где продукты ПЦР выявляются методом ELISA, также часты в применении.
Существуют и другие методы анализа продукта амплификации. Они включают высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез, и масс-спектрометрию. Внедрению данных подходов могла бы способствовать автоматизация считывания результатов. Следует особо подчеркнуть, что подобные техники сейчас используются в биочипах для детекции продуктов амплификации.
Говоря о ПЦР и техниках гибридизации, следует упомянуть принципиально новое направление в развитии систем регистрации: оптические биосенсоры. Диагностика патогенов посредством данных устройств не требует модификации ПЦР-продуктов или введения зондов. Биосенсоры позволяют определять в режиме реального времени пикограммы фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на поверхности оптической ячейки. Конструкция ячейки в идеале дает возможность проводить ее регенерацию после каждого цикла определения и многократно использовать одну и ту же ячейку. Применение оптических биосенсоров может быть весьма перспективным для количественной детекции фитопатогенов.
В современной фитопатологии ПЦР применяют не только для диагностики патогенов растений, но также в таксономии и филогении вироидов, вирусов, фитоплазм, бактерий, грибов, оомицетов и нематод. Эта техника широко используется для мониторинга болезней растений, а также для детекции возбудителей болезней в органах вегетирующих растений, семенах, фруктах и другой хранящейся продукции растениеводства. Она была применена для обнаружения вирусов многих экономически важных сельскохозяйственных культур и других культивируемых растений. Перечень видов, рас и изолятов оомицетов и грибов также включает представителей наиболее вредоносных таксонов (например, Phytophthora, Pythium, Aspergillus, Colletotrichum, Fusarium, Gaeumannomyces, Helmintosporium, Mycosphaerella, Phoma, Puceinia, Rhizoctonia, Septoria, Tilletia, Ustilago, Verticillium). Протоколы ПЦР были разработаны для многих важных фитопатогенных бактерий, и ряд праймеров, подходящих для их идентификации, приведен в соответствующих руководствах по идентификации фитопатогенных бактерий. Список некоторых экономически значимых болезней сельскохозяйственных растений, ПЦР-диагностика возбудителей которых уже получила практическое использование в сельском хозяйстве, приведен в табл. 3.2. Метод ПЦР применяется также для обнаружения фитопатогенных нематод, в частности с целью контроля золотистой и бледной картофельных нематод, являющихся карантинными объектами.
Методы с использованием ПЦР

  • Анализ состава жирных кислот при идентификации фитопатогенных бактерий
  • Количественная обработка результатов ПЦР
  • Разновидности метода ПЦР
  • Методы гибридизации нуклеиновых кислот
  • Другие методы иммунодиагностики фитопатогенов
  • Быстрые ELISA-тесты
  • Некоторые примеры практического использования ELISA
  • Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии
  • Методы диагностики, основанные на взаимодействии антител с антигенами фитоп ...
  • Современные методы диагностики фитопатогенов

  • Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

    Министерство сельского хозяйства Оренбургской области

    Правительство Оренбургской области

    Визитка компании - сайт компании

    Ильинка Фаворит Агромир Техноорь

    Системы точного земледелия Автопартнер





    Акцент

     

    • Рейтинг@Mail.ru
    • Яндекс.Метрика
    • Индекс цитирования