Определение маркерных метаболитов грибов в тканях инфицированных растений

Фитопатогенные грибы продуцируют целый ряд вторичных метаболитов, которые не встречаются в растениях или присутствуют в них в следовых количествах. Накопление таких веществ в растительных тканях свидетельствует о развитии и распространении патогена в инфицированном растении. Такие характерные для грибов метаболиты могут служить своеобразными маркерами инфекции, а их количество может отражать степень ее развития. Хотя определение маркерных метаболитов не позволяет различать виды фитопатогенных грибов, биохимический анализ этих веществ достаточно точно характеризует степень устойчивости сортов, позволяет проводить скрининг наиболее эффективных фунгицидов, а также получать более достоверную информацию о процессе патогенеза при изучении болезней со сложной визуальной симптоматикой, таких, например, как фузариоза колоса. Типичными маркерными метаболитами грибов, используемыми в подобных исследованиях, являются эргостерин, полиолы (арабит и маннит) и хитин.
Эргостерин. Стерины — интегральные компоненты липидного слоя мембран живых организмов чрезвычайно широко распространены в природе, но эргостерин встречается почти исключительно в составе клеточных мембран грибов, где он к тому же является доминантным стерином.
Как и другие стерины, он регулирует конформационные изменения мембран и способствует выживанию микроорганизмов в неблагоприятных условиях. Следует подчеркнуть, что оомицеты (Phytophthora и Pythium) не способны синтезировать стерины и включают в свои мембраны стерины, полученные из растения-хозяина.
Полиолы. По химической природе полиолы — это нециклические многоатомные спирты. Хотя они обнаружены у некоторых растений, основными продуцентами этих вторичных метаболитов в природе являются грибы. В клетках грибов такие полиолы как арабит и маннит присутствуют в чрезвычайно высоких концентрация и выделяются во внешнюю среду. Они выполняют различные физиологические функции, в том числе являются осмопротекторами и, вероятно, запасными углеводами грибных спор.
Хитин представляет собой природный полимер N-ацетилглюкозамина. У грибов хитин входит в состав клеточной стенки спор и гиф. Наряду с глюканом он формирует микрофибриллы, структурируя клеточную стенку. По своим физико-химическим свойством грибной хитин отличается от хитина ракообразных Продуктом деацелирования хитина является хитозан, широко известный как индуктор защитных реакций растений. Клеточные стенки оомицетов не содержат хитина.
Количественный анализ эргостерина, арабита, маннита и хитина был применен для оценки степени колонизации тканей растений пшеницы, зараженных ржавчинными грибами (Puccinia graminis f. sp. tritici и P. recondita), возбудителями фузариозной корневой гнили и фузариоза колоса (в частности Fusarium culmorum, F. sambucinum и F. grminearum), возбудителем листовой пятнистости Stagonospora nodorum, а также растений риса, инфицированных возбудителем перикуляриоза (Magnaporthe oryzae). Эти метаболиты выделяли из растительных тканей и сразу или после дериватизации определяли их количество газожидкостной (ГЖХ) или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
Хотя биохимические тесты гораздо менее чувствительны по сравнению с ПЦР и ELISA, они позволяют с достоверностью обнаруживать микрограммы грибных метаболитов на грамм растительной ткани. Такие количества нередко накапливаются в зараженном растении на относительно ранних этапах патогенеза. Было установлено, что во многих случаях, в частности при развитии фитопатогенных грибов в растениях пшеницы и риса, динамика накопления маркерных метаболитов отражала реальный ход болезни. При этом динамика накопления эргостерина соответствовала динамике накопления вегетативного мицелия и позволяла судить о росте и распространении патогена по растению, в то время как увеличение содержания полиолов наблюдалось на более поздних стадиях соответствующих спорообразованию.
Поскольку определение маркерных метаболитов проводится с помощью многостадийного анализа, включающего их экстракцию, очистку от коэкстративных веществ, дериватизацию, все препаративные и аналитические процедуры должны быть оптимизированы и стандартизованы на столько, насколько это возможно.
Маркерные метаболиты и исследование степени устойчивости растений
Эксперименты, в которых изучали развитие болезней в сортах пшеницы с разным уровнем восприимчивости к ржавчинным грибам, показали, что в стандартизованных условиях инокуляции и выращивания растений, динамика накопления маркерных метаболитов отражает скорость накопления грибной биомассы, что в свою очередь соответствует степени восприимчивости сорта. Иными словами, за одно и то же время в менее восприимчивых сортах накапливалось меньше биомассы и обнаруживалось меньшее содержание маркерных метаболитов, чем в высоковосприимчивых. Эти результаты оказались полезными при скрининге сортов с медленным развитием болезни. Ни в лабораторных условиях, ни в поле не составляет большой сложности отличить устойчивый сорт от восприимчивого по внешним признакам заболевания.
Ho в полевых экспериментах труднее оценить уровень устойчивости толерантных сортов с медленным развитием болезни, поскольку у них часто наблюдается та же симптоматика, что у восприимчивых. Однако, на фоне высокой степени совместимости партнеров, патоген хуже распространяется в тканях толерантных сортов, и ход болезни замедляется, что позволят растениям выживать и давать урожай. Оказалось, что степень устойчивости или восприимчивости сорта можно определить в вегетационных экспериментах с проростками, выращенными и зараженными в контролируемых условиях. Важно, что во многих случаях, характеристика степени устойчивости/восприимчивости, полученная в лаборатории для проростков, подтверждается полевыми испытаниями. Так, было установлено, что результаты определения содержания полиолов в первом листе проростков восьми сортов пшеницы, искусственно инфицированных стеблевой ржавчиной, хорошо коррелируют с данными, полученными в ходе нескольких полевых испытаний, охватывающих весь вегетационный период.
Количественное определение маркерных метаболитов паразитических грибов в растениях позволяет также получать информацию об эффективности тех или иных фунгицидов, определять стадии их оптимального применения, а иногда и продемонстрировать механизм их действия (подавление роста патогена или торможение его спорогенеза).