PR-белки

PR-белки (pathogenesis-related proteins) или белки, связанные с патогенезом, были впервые обнаружены вирусологами в листьях сорта табака, который реагировал реакцией СВЧ на заражение ВТМ. Позднее различные PR-белки были обнаружены во многих других видах растений, но белки табака исследованы наиболее полно. В связи с этим, настоящий раздел посвящен главным образом PR-белкам табака и принятой для них номенклатуре.
Термин «белки, связанные с патогенезом», означает группу белков, которые индуцируются в растении в ответ на грибные, бактериальные, вирусные, вироидные болезни, а также некоторые химикаты. Первые исследователи пришли к выводу, что все PR-белки обладают определенными общими свойствами: они растворимы только в кислых условиях (pH — 3), присутствуют в экстрацеллюлярной жидкости и высоко устойчивы к деградации протеолитическими ферментами. Казалось бы, это логично, поскольку экс-трацеллюлярная жидкость вокруг некротической зоны имеет низкое значение pH и высокую протеолитическую активность, поэтому обладающие соответствующими свойствами белки должны быть хорошо адаптированы к этим условиям. Позднее, однако, было выяснено, что некоторые PR-белки (например, томата и картофеля) оказались не кислыми, а основными, к тому же разрушающимися протеолитическими ферментами.
Затем у табака был обнаружен второй набор PR-белков, которые были локализованы не в межклеточной жидкости, а в вакуолях, и конституционно экспрессировались в корнях. Основные белки индуцируются в листьях при обработке этиленом и в результате поранения, тогда как кислые в этих условиях не экспрессируются.
Все PR-белки табака разделяют на несколько групп. Каждый кислый экстрацеллюлярный белок имеет цифру, обозначающую группу, а также различными буквами: «а», «b», «с» и т. д. Нумерация основывается на относительной мобильности при электрофорезе в неденатурирующей гелевой системе. Различные белки, обозначенные одним и тем же номером (например, PR-1a, PR-1b, PR-1c), серологически родственны, имеют близкую молекулярную массу и обладают частичным сходством в аминокислотной последовательности.
Гены, кодирующие PR-белки, экспрессируются разными сигнальными путями. PR-1, PR-5 индуцируются салициловой кислотой (СК). Ген PR-4 индуцируется СК, жасмоновой кислотой (ЖАК) и этиленом, ген PR-12 (Arabidopsis defensine gene) индуцируется этиленом и ЖАК, но не СК. Индукция этиленом табачного гена PR-2 обусловлена наличием в промотор-ной части гена GCC-бокса, связывающегося с этиленом.
PR-1 тип белков
Среди белков, накапливающихся в листьях табака в ответ на ВТМ, найдены кислые формы PR-la, PR-16 и PR-1c, которые имеют сходную молекулярную массу и аминокислотную последовательность, а также серологическую близость. Кроме табака, эти белки были обнаружены в инфицированных коровьем горохе, картофеле, кукурузе, ячмене и томате. Подобное широкое распространение белков типа PR-1, как у однодольных, так и у двудольных растений, подтверждает их важную роль в ответах растений на стресс.
Другую подгруппу составляют основные PR-подобные белки. По аминокислотной последовательности они на 65 % похожи на вышеупомянутые кислые белки табака. По аналогии с кислыми PR-белками основные белки содержат гидрофобный N-терминальный участок, состоящий из 30 аминокислот, который, возможно, функционирует как сигнальный пептид, необходимый для прохождения через мембрану. Геном табака может содержать свыше 6 генов, соответствующим основным PR-белкам. Белки группы PR-1 из листьев томата ингибируют прорастание зооспор и патогенность Phytophthora infestans.
Накопление PR-белков при инфицировании патогенами, вызывающими некроз и приобретение растениями устойчивости к последующему заражению, позволили предположить, что PR-белки из группы 1 участвуют в системной приобретенной устойчивости.
PR-2 тип белков: β-1,3-глюканазы
β-1,3-глюканазы способны разрушать клеточные стенки некоторых грибов, а также выщеплять из них фрагменты, обладающие иммунорегулирующими свойствами (эндогенные элиситоры и супрессоры). Первоначально были обнаружены 3 кислых экстрацеллюлярных белка, обозначенных соответственно PR-2a, PR-26, PR-2c. Затем были идентифицированы еще два дополнительных кислых белка, которые также, как и первые, оказались β-глюканазами. Кроме кислых глюканаз идентифицирована основная глюканаза, которая вместе с глюканазой PR-2c обладает в 50-250 раз большей активностью деградации ламинарина (β-1,3-глюкан, запасной углевод оомицетов), чем все остальные глюканазы. Основная глюканаза накапливается в вакуолях и экспрессируется конституционно в корнях, нижних листьях и цветках неинфицированного табака до высокой концентрации, но в верхних листьях обнаруживается лишь в результате заражения.
На основе секвенирования последовательности аминокислот глюканазы объединены в 3 класса. Класс I включает основные белки с мм около 33 кДа, локализованные в вакуолях. Они образуются как протобелки, подвергаемые энзиматическому протеолизу. В классы II и III входят кислые белки с мм около 36 кДа. Микромолярные дозы PR-2 белков (= 50 мкг/мл) проявляют антигрибную активность против широкого спектра патогенов растений и животных.
В библиотеке кДНК табака идентифицированы три участка последовательностей, соответствующих основным глюканазам, и 5 зон, кодирующих кислые глюканазы. Предполагается, что β-1,3-глюканазы играют роль в процессах, ведущих к СВЧ-ответу растительной ткани.
PR-3 тип белков: хитиназы
Эндохитиназы разделяют на 5 групп или классов. Молекулы класса 1 (мм = 32 кДа) содержат N-терминальный домен, богатый остатками цистеина (= 40 аминокислот), домен, связывающий хитин, близкий к хевеину, и высоко консервативный центральный участок. Класс II (27-28 кДа) не имеет N-терминального домена, богатого остатками. Белок класса III (28-30 кДа) не гомологичен белкам из других классов. Белок класса IV подобен белку класса I, но короче его вследствие наличия 4-х делеций. Класс V (41-43 кДа) включает белки, сходные с бактериальными хитиназами.
В растениях хитиназа и β-глюканаза экспрессируются при патогенной инфекции, поранении и обработке элиситорами, причем их экспрессия, как правило, коррелирует с устойчивостью. Поэтому полагают, что PR-белки 2-й и 3-й групп участвуют в индуцированной устойчивости растений. Особенно эффективно ингибируют рост патогенов сочетание хитиназ и β-глюканаз.
Хитиназы класса I чрезвычайно полиморфны, причем аминокислотные замещения преобладают в активном центре белка, осуществляющем связь с молекулой хитина. Поскольку структуры грибного хитина практически не варьирует, полагают, что хитиназы растений ко-эволюционируют с грибными ингибиторами хитиназ — небольшими белковыми или углеводными молекулами, ингибирующими разрывы хитина хитиназами.
PR-4 тип белков
PR-4 белки разделяют на 2 подкласса. Подкласс I представляет собой хитин-связывающие белки с мм 13-14,5 кДа. Они имеют сходство с хитин-связывающим лектином хевеином. Подкласс 2 не имеет домена связывания с хитином. Белки из обоих классов имеют широкий спектр антигрибной активности. Серологически сходные белки накапливаются в апопластной жидкости томатов, зараженных Cladosporium fulvum.
PR-5 тип белков: тауматиноподобные белки
К этой группе относятся два белка табака, которые также отсутствуют в незараженных растениях. Их молекулярная масса без гидрофобного N-терминального участка, который, возможно, служит сигнальным пептидом, ориентировочно составляет 24 кДа. Исследование амнокислотных последовательностей белков группы PR-5 обнаружило их сходство с сладкими на вкус белками тауматинами из африканского кустарника Taumatococcus daniellii (поэтому их называют TL-белками), а также с α-амилазатрипсиновым ингибитором кукурузы. Геном табака содержит два гена белков из группы PR-5.
Тауматиноподобные белки имеют большое структурное сходство с осмотином, который накапливается в культуре клеток табака, адаптированных к осмотическому стрессу. Он был также обнаружен в незараженных корнях табака. Ho ни осмотин, ни PR-5 белок не имеют сладкого вкуса, присущего тауматину. Белки группы PR-5 обладают антигрибной активностью. Они ингибируют рост гиф, прорастание спор, вызывают лизис и снижение жизнеспособности растков спор. Белки этой группы зеяматин (из кукурузы), осмотин (из табака), линуситин (из льна) вызывают быстрое повышение проницаемости мембран и потерю цитоплазматического содержимого из грибных клеток. Осмотин индуцирует прогаммируемум смерть (апоптоз) у дрожжей вследствие аккумуляции активных форм кислорода (АФК).
У черного паслена (Solanum nigrum) PR-5-белки, синтезируются конститутивно; их наличие вносит важный вклад в неспецифическувю устойчивость паслена к Phytophthora infestans.
Сходство PR-5 белков с бифункциональным а-амилазопротеиназным ингибитором кукурузы (60 % идентичности по аминокислотным последовательностям) делает вероятным предположение о функциях этих белков в индуцированной устойчивости против широкого круга патогенов и вредителей, возможно, состоящей в ингибировании пищеварительных ферментов.
Использование методов изоляции PR-белков в табаке привело к обнаружению многочисленных белков в других видах растений, которые также условно можно отнести к белкам, связанным с патогенезом. Это — ингибиторы репликации вирусов, продукты генов, кодирующих раневые реакции картофеля, ингибиторы протеиназ, тионины, структурные белки клеточных стенок, ферменты ароматического биосинтеза, пероксидазы, супероксиддисмутазы и др. В настоящее время сложно ответить, можно ли относить все эти белки к PR-белкам только по одному признаку — индукции в ответ на стрессы.
Для некоторых вышеописанных белков известны функции, и тем самым, можно понять ту специфическую роль, которую играет тот или иной белок в процессах патогенеза. Так, индуцированные заражением пероксидазы участвуют в биосинтезе лигнина и суберина, препятствуют распространению патогенов в растении и повреждениям, которые они вызывают. Подобным же образом ясна роль ингибиторов протеиназ, препятствующих питанию патогенов. Глюканазы и хитиназы способны разрушать клеточные стенки гриба и, возможно, бактерий.
Однако для многих групп PR-белков функции еще далеко не установлены. Некоторые белки, которые специфически индуцируются патогенами в одном органе, могут конституционно экспрессироваться в тканях других растений или даже в других органах того же растения, всегда или в определенный период развития. Вряд ли можно не согласиться с мнением, что исследование функций PR-белков у растений является одним из наиболее сложных, неясных, а порой и противоречивых разделов фитопатологии.