Антивирусные белки

Белки — ингибиторы вирусов представляют собой особую группу растительных антибиотических веществ. Описание этих ингибиторов и механизмов их действия заслуживает специального раздела.
Конституционные антивирусные белки
Процесс инфицирования растения вирусом может быть разделен на две фазы — на стационарную фазу и фазу репликации. События, происходящие во время стационарной фазы, включают в себя:
• первоначальное механическое повреждение поверхности листа в месте внедрения;
• проникновение вируса в клетку;
• отделение оболочки вириона от вирусной нуклеиновой кислоты (депротеинизация).
Фаза репликации характеризуется:
• синтезом вирусных нуклеиновых кислот и белков;
• сборкой вириона;
• транспортом вновь синтезированных вирусных частиц в другие клетки, в другие части растения.
Понятия «ингибитор стационарной фазы в жизненном цикле вируса» и «ингибитор репликации вируса» не имеют четко обозначенных различий из-за того, что депротеинизация инокулюма перекрывается во времени с началом синтеза вирусного белка и нуклеиновых кислот.
Принято считать, что вещество является ингибитором репликации, если оно способно блокировать инфекцию при обработке растений спустя 5-8 часов после заражения вирусом. Будем использовать это, в некоторой степени, искусственное определение при обсуждении механизмов действия антивирусных белков — AVP (antiviral proteins).
Обычно при анализе антивирусной активности того или иного ингибитора его смешивают с вирусной суспензией, инокулируют такой смесью листья сверхчувствительного растения-хозяина и, в дальнейшем, подсчитывают количество возникших инфекционных пятен. Уменьшение количества инфекционных пятен означает, что имеет место блокирование стационарной фазы развития вирусной инфекции. Однако, количество инфекционных пятен может также снижаться, если репликация вируса ингибируется до такой степени, что видимые пятна не образуются, поэтому данный тест не позволяет достаточно точно отделить воздействие ингибитора на стационарную фазу вирусной инфекции от его воздействия на фазу репликации.
Наиболее репрезентативными тестами, дающими возможность судить о воздействии ингибитора на репликацию вируса являются следующие:
• определение средних размеров инфекционных пятен;
• тестирование действия ингибиторов на протопластах;
• анализ накопления вирусов в системно-инфицируемых тканях;
• обработка растений ингибитором спустя несколько часов после инокуляции вирусом.
Все известные в настоящее время антивирусные белки можно разделить на эндогенные (синтезируемые конститутивно) растительные антивирусные белки — EAVP (endogenous antiviral proteins) и белки-ингибиторы, синтез которых индуцируется в ответ на инфекцию — IAVP (induced antiviral proteins). Оба типа белков-ингибиторов имеют много сходных физикохимических и биологических характеристик, таких как:
• устойчивость к изменениям pH и термостабильность;
• способность осаждаться высокими концентрациями сульфата аммония;
• активность при очень низких концентрациях;
• широкий спектр антивирусного действия;
• влияние содержания аминогрупп на биологическую активность. Эндогенные противовирусные белки (EAVP) — это постоянно продуцируемые растением, а не индуцируемые в нем стрессом ингибиторные белки, которые, будучи экстрагированными из ткани растений-хозяев, могут блокировать развитие вирусной инфекции в обработанных ими растениях.
Некоторые растения могут содержать более одного EAVP. Так, экстракты из листьев перца, герани и дурмана содержат высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты, обладающие антивирусной активностью.
Известно, по крайней мере, 4 различных, механизма защитного действия EAVP:
1. агрегация ингибитора с вирионом;
2. ингибирование стационарной фазы вирусной инфекции;
3. индукция системной устойчивости к вирусу;
4. ингибирование репликации путем блокирования белкового синтеза. Некоторые EAVP полифункциональны, т. е. обладают более чем одним типом биологической активности, что, в некоторых случаях осложняет изучение механизмов их антивирусного действия.
Разберем каждый из вышеперечисленных типов антивирусной активности.
Агрегация. Это — чисто физическое явление, зависящее от ионной силы внутри инфицированной клетки, концентрации ингибитора и вирионов. EAVP из Phytolacca esculenta и P. americana, PAP-I и PAP-II, могут агрегировать с вирусными частицами, образовывая нерастворимый осадок. Однако, агрегация вирионов, по-видимому, — не единственный механизм противовирусного действия этих ингибиторов; возможно, они также индуцируют устойчивость растения-хозяина.
Ингибирование стационарной фазы инфекционного процесса. Как было сказано выше, особенностью воздействия ингибиторных белков на стационарную стадию развития вирусной инфекции является снижение количества инфекционных пятен на обработанных этими ингибиторами листьях. Типичными представителями ингибиторов стационарной стадии являются EAVP, выделенные из Datura stramonium и Dianthus caryophyllus. Обработка растений этими ингибиторами приводит к уменьшению количества инфекционных пятен, размер же инфекционных пятен при этом не изменяется. EAVP из D. stramonium и D. caryophyllus не влияют также на 155 титр вируса в системно инфицированном растении.
Экспериментально установленные в ряде опытов соотношения между логарифмом количества инфекционных пятен на листьях и логарифмом концентрации вируса в листовой ткани свидетельствуют о том, что на поверхности листа имеется определенное число сайтов, потенциально способных развиваться в инфекционное пятно. Другими словами, число рецепторов, способных взаимодействовать с вирусными частицами, ограничено, и они расположены в определенных точках листа. Предварительная обработка поверхности листа гомологичным белком вирусной оболочки приводит к снижению числа инфекционных пятен при заражении. Это можно объяснить конкуренцией между белком оболочки вируса и интактными вирусными частицами за взаимодействие с рецепторами. Причем взаимодействие это носит высоко специфический характер, так как при обработке гетерологичным вирусным белком такого рода конкуренция не наблюдается.
Вполне возможно, что гипотетические рецепторы могут являться точками приложения эндогенных антивирусных белков-ингибиторов. По-видимому, разные рецепторы имеют разную степень сродства к EAVP, так как обработка листьев одного и того же растения-хозяина индуцирует разную степень устойчивости по отношению к разным вирусам. Аналогично этому разная степень устойчивости наблюдается и при обработке ингибитором разных видов растений-хозяев.
Важную роль в связывании EAVP с рецепторами растения-хозяина, вероятно, играют аминогруппы. Наличие этих радикалов, по-видимому, позволяет ингибитору связываться с рецептором и блокировать, таким образом, вирус-специфические сайты на поверхности листа. Снижение химическим путем содержания аминогрупп в молекулах ингибитора приводит к снижению его антивирусной активности. С другой стороны, показано, что аминогруппы необходимы для успешного заражения растений табака вирусом табачной мозаики. Таким образом, есть основания предполагать, что именно аминогруппы в молекулах антивирусных белков являются детерминантами, ответственными за конкурентное связывание с растительными рецепторами.
Для некоторых растений (таких, например, как Chenopodium аmаraun-ticolor или Physalis floridana) характерна восприимчивость ко многим вирусам, различающимся по структуре и биологии. По-видимому, у этих растений имеются различные рецепторы, специфичные для каждого из вирусов.
Индукция системной устойчивости. Процесс возникновения индуцированной устойчивости в растительных системах может быть разбит на три последовательные стадии:
1) восприятие растением, биотического или абиотического стресса;
2) возникновение системного сигнала, как одна из реакций на стресс на клеточном уровне;
3) индуцирование этим сигналом в тканях нового физиологического со стояния, которое защищает ткани от последующего воздействия того же самого или, иногда, других стрессов.
Было обнаружено, что некоторые растительные экстракты при испытании на тестерных растениях индуцируют системную устойчивость к вирусам и показано, что индуктор устойчивости имеет белковую природу. Из растительной ткани, ставшей устойчивой в результате стрессовых воздействий и реализации системного сигнала, вызванного данным индуктором, могут быть выделены белки, обладающие свойством подавлять развитие вирусной инфекции. Белковые ингибиторы вируса — VIA (virus inhi-bitory agents). VIA ингибируют вирусную инфекцию при инокуляции в смеси с вирусом. Они также могут индуцировать системную устойчивость при обработке растений перед инокуляцией вирусом. Молекулярные веса VIA колеблются от 13,5 до 15 кДа.
Синтез VIA в растительных тканях и связанная с этим системная устойчивость полностью блокируются, если в эти ткани сразу после обработки индуктором вводится актиномицин D. Как известно, антибиотик актиномицин D является ингибитором белкового синтеза. Индукция VIA частично блокируется актиномицином D при использовании его в течение 8 часов после обработки листьев индуцирующим экстрактом. Однако снижения концентрации VIA или понижения уровня системной устойчивости не происходит если актиномицин D применяется через 24 часа после обработки индуктором. Эти экспериментальные данные свидетельствует о том, что:
1) уровень накопления VIA в растениях коррелирует с развитием системной устойчивости;
2) белковый синтез, связанный с обоими процессами, завершается через 24 часа после индукции.
Примерами VIA могут быть эндогенные белковые ингибиторы из вытяжек Capsicum frutescens и Chenopodium ambrosoides, которые индуцируют системную устойчивость к вирусу верхних листьев растений при обработке ими нижних листьев до инокуляции вирусом.
Инактивация рибосом. Белки, ингибирующие рибосомы (RIP — ribosome inhibitory proteins), являются антивирусными, так как они ингибируют белковый синтез, блокируя реализацию последних стадий внутриклеточного развития вируса. RIP специфически инактивируют рибосомы, в результате чего синтез белка блокируется на стадии элонгации. Имеется значительная гомология первичной структуры у RIP, выделенных из разных источников. Это позволяет сделать вывод о том, что ингибирующая активность данных пептидов в определенной степени коррелирует с первичной структурой их активных сайтов, ответственных за связывание с рибосомой.
Первоначально предполагалось, что RIP неактивны на гомологичных рибосомах. Однако низкая активность рибосом фитолакки американской в экспериментах по внеклеточной трансляции привела к открытию того, что рибосомы фитолакки фактически инактивируются RIP фитолакки (PAP-1) в процессе их выделения. Другие растительные рибосомы также блокируются под действием своих собственных RIP в аналогичных условиях. Следует, однако, заметить, что рибосомы фитолакки все-таки достаточно устойчивы к добавлению собственного RIP (PAP-1) и гораздо более чувствительны к действию RIP, выделенных из других растений. В то же время тритин, пшеничный RIP, не инактивируют рибосомы из пшеницы, так что выделенные пшеничные рибосомы сохраняют высокую активность.
Накопившиеся к настоящему времени экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что RIP имеют специфическую активность по отношению к рибосомам, выделенным из разных видов растений. По-видимому, рибосомы имеют некие структурные особенности, которые могут узнаваться или не узнаваться различными RIP. Механизмы функционирования этих белков, однако, не так просты: имеются данные о том, что PAP-S (RIP из семян фитолакки американской) ингибирует рост клеток моркови в жидкой культуре, в то же время он в тех же концентрациях стимулирует рост клеток риса.
Временной интервал антивирусной активности довольно узок, поэтому антивирусная активность большинства RIP тестируется путем инокуляции растений смесью этих белков с вирусным препаратом или препаратом вирусных РНК. Обработка растений RIP через некоторое время после инокуляции не предотвращает развитие вирусной инфекции. Так, защитный эффект не обнаруживается если RIP фитолакки американской (PAP-1) применяют через 30-50 минут после инокуляции протопластов табака ВТМ. Следовательно, RIP активны только на очень ранних стадиях жизненного цикла вируса. Известно, что рибосомы хозяина могут связывать вирусную РНК почти сразу после того, как РНК-вирус теряет оболочку. Возможно, что трансляционный комплекс «вирусная РНК — рибосома» уже невосприимчив к действию RIP, и в течение того времени, пока этот комплекс существует, RIP являются неактивными.
Индуцируемые антивирусные белки
Кроме конституционных метаболитов растений, — эндогенных антивирусных белков (EAVP), в инфицированных растениях обнаруживаются антивирусные белки, синтез которых индуцируется в ответ на инфекцию, и которые отсутствуют в тканях здоровых растений до заражения. Их называют индуцированными антивирусными белками (IAVP). В отличие от EAVP, которые оказывают влияние на ранние фазы жизненного цикла вируса, и с которыми индуцированные белки-ингибиторы имеют много общих характеристик, IAVP являются ингибиторами поздних стадий вирусной инфекции. Это следует из того факта, что обработка растений IAVP вызывает значительное снижение вирусного титра в растении. Кроме того, эффективность IAVP сохраняется даже при их применении спустя много часов после инокуляции вирусом.
Поскольку IAVP в растениях присутствуют в тканях, обладающих системной устойчивостью, они рассматриваются многими исследователями как возможные кандидаты на роль сигнальных молекул при развитии системной приобретенной устойчивости растений к вирусам. Однако низкий уровень экспрессии генов, кодирующих эти белки, значительно затрудняет выделение последних из растительных тканей в виде очищенных препаратов с целью дальнейшего изучения. Тем не менее, к настоящему времени проведены довольно подробные исследования нескольких IAVP.
Ингибитор вирусной репликации (IVR — inhibitor of viral replication) из растений табака состоит из двух биологически активных белков — 26 кДа и 57 кДа, которые являются, соответственно, мономером и димером. IVR может быть выделен из инфицированных BTM протопластов и тканевых экстрактов сверхчувствительных сортов табака. Этот высокоактивный IVR накапливается в тканях в очень низких концентрациях, 10 нг/г ткани. Столь низкое содержание IVR в растениях, по-видимому, является причиной того, что транскрипты IVR не обнаруживаются в соответствующих тканевых экстрактах.
IVR неспецифичен в смысле своей антивирусной активности, потому что он ингибирует репликацию нескольких различных вирусов, кроме индуцирующего его ВТМ. IVR может подавлять размножение вирусов в протопластах при применении не позже, чем через 18 часов, а в листовых дисках — не позже, чем через 5 часов после инокуляции. В неинокулированной дистальной листовой ткани IVR обнаруживают уже через 30-36 часов после инокуляции вирусом, хотя в верхних листьях он обнаруживается на 7-14 день после инокуляции.
IVR может быть выделен как из инфицированных вирусом так и из неинокулированных тканей пораженного растения и, по-видимому, его образование является одной из защитных реакций растения-хозяина, направленных на локализацию вирусной инфекции.
IVR — типичный ингибитор вирусной репликации, потому что:
1) он может понижать концентрацию вирусных частиц в тканях системно-инфицированных растений-хозяев;
2) он эффективен при применении от 5 и более часов после инокуляции вирусом и даже может быть эффективен спустя 18 часов после инокуляции.
Ингибиторы из «зеленых островков». На листьях, инфицированных некоторыми вирусами, развиваются светлые и темно-зеленые участки — классический симптом вирусной мозаики. Клетки «зеленых островков» обычно содержат меньше вируса по сравнению со светло-зелеными участками листа и выглядят неинфицированными цитологически или физиологически. «Зеленые островки» проявляют системную устойчивость к последующей реинфекции тем же самым или близкородственными системными вирусами.
Причины безвирусной природы «зеленых островков» пока не найдено. He исключено, что в поддержание низкой концентрации вируса в зеленых островках вовлечены IAVP, присутствующие в системно инфицированных тканях. Обнаруженные в «зеленых островках» индуцированные антивирусные белки, ответственные за подавление вирусной инфекции, принято называть ингибиторами из «зеленых островков» — IGI (inhibitors from green islands). Они имеют много сходных черт с другими IAVP. Например, IGI, выделенный из «зеленых островков» огурца, инфицированного вирусом огуречной мозаики, очень похож на IVR из табака. Он, также как IVR табака, имеет две активные фракции близких молекулярных весов, воздействует на репликацию вируса и реагирует с антисывороткой к IVR.
IGI, выделенные из «зеленых островков» разных растений, отличаются серологически.
Интересно, что IGI табака может ингибировать размножение BTM в протопластах и листовых дисках, обработанных этим ингибитором после их инокуляции вирусом, но ткани «зеленых островков», из которых IGI был выделен, остаются восприимчивыми к некрозообразующему штамму ВТМ.
Антивирусные факторы. Термином антивирусные факторы — AVF (antiviral factors) обозначают антивирусные белки, активность которых связана с наличием в растениях табака N-гена сверхчувствительности.
Один из таких AVF представляет собой фосфорилированный гликопротеин с молекулярной массой 22 кДа, который существует в растении в форме предшественника, pre-AVF. Его процессинг индуцируется вирусной инфекцией, возможно, в ответ на появление в клетках двуцепочечной РНК (dsPHK) — репликативной формы вирусной РНК.
Подобно IVR табака, AVF индуцируются только вирусной инфекцией, ингибируют репликацию вирусов и могут играть роль в развитии системной приобретенной устойчивости. AVF обнаруживается после системной инфекции, даже при очень низкой степени заражения. По-видимому, уровень накопления AVF может определять, будет ли вирусная инфекция локализованной или станет системной.
AVF, подобно IVR, являются мощными ингибиторами и экспрессируются в очень малых количествах, что затрудняет выделение и дальнейший анализ этих белков. Так же как в случае IVR, m-РНК, соответствующую AVF-транскриптам, не удается обнаружить в инфицированных вирусом растениях.
Интересно, что AVF имеют много общих характеристик с интерферонами, включая температурную и кислотную стабильность, гликозилирование, широкий антивирусный спектр, стимулирование синтеза олигоаденилатов.
В частности, AVF из растений табака стимулирует олигоаденилатсинтазу, а олигонуклеотиды могут активировать AVF. Показано, что в некоторых случаях человеческие интерфероны способны ингибировать размножение растительных вирусов. Кроме того установлено, что индуцированные человеческими интерферонами олигоаденилаты, также как и синтетические 2'-5'-олигоаденилаты, ингибируют размножение BTM в растениях табака.