Ферменты, участвующие в синтезе фенилпропаноидов и лигнина

Как было указано выше, фенилпропаноидные соединения представляют собой широкой спектр структурных циклических веществ, обладающих разнообразными физиологическими функциями. Они образуются в результате дезаминирования аминокислоты фенилаланина ферментом фенилаланин-аммиак лиазой (ФАЛ).
Простые фенилпропаноиды имеют структуру С6-С3 -— углеродный скелет фенилаланина (рис. 5.20). Из коричной кислоты образуются в результате реакций гидроксилирования, метилирования и дегидрирования фенольные (р-кумаровая, кофейная, феруловая, синаповая кислоты), а также простые кумарины (умбеллиферон, псорален). Свободные кислоты редко накапливаются в растительных клетках до высоких уровней: они обычно конъюгированы с сахарами (например, конъюгат салициловой кислоты с глюкозой), углеводами клеточных стенок (эфиры феруловой кислоты) или органическими кислотами (эфиры синаповой, хлорогеновой кислот). Салициловая, бензойная и р-оксибензойная кислоты не являются истинными фенилпропаноидами, поскольку они лишены трикарбоновой цепи, которая свойственна коричной и р-кумаровой кислотам.
Многие стресс-индуцированные фенилпропаноиды обладают Cl5 флавоноидным скелетом, который синтезируется через халконсинтетазу, конденсирующую р-кумарил-СоА и три молекулы малонил-СоА. Таким образом, халконсинтетаза соединяет два фенольных кольца, одно из которых синтезировано через шикимовую кислоту, а второе — через уксусную (эти два пути синтеза фенолов описаны в начале главы). У большинства семейств растений начальным продуктом халконсинтетазы является тетраоксихалкон, который далее превращается в другие классы флавоноидов, такие как флавоны, флаванолы, антоцианы и 3-деоксантоцианидины. У растений семейства бобовых, которые наряду с халконсинтетазой обладают и ферментом халконредуктазой, может образовываться триоксихалкон. У ряда видов, включая сосну, виноград и арахис, конденсация р-кумарол-СоА или CoA коричной кислоты с тремя молекулами малонилСоА, катализуемая ферментом стильбенсинтетазой, может привести к образованию стильбенов. У бобовых изофлавонсинтетаза модифицирует изофлавоноидный углеродный скелет, в результате чего накапливается ряд простых изофлавоноидов — куместаны, изофлаваны, птерокарпаны. Между фенилпропа-ноидами могут существовать структурные различия, определяемые гирок-силированием, гликозидированием, алкилированием, пренилированием, сульфатацией и метилированием.
По мере того, как совершенствуется техника молекулярной биологии, а также очистки многих ферментов и использования радиоактивной метки, выясняются и этапы превращения фенилпропаноидов. рис. 5.21 суммирует типы фенилпропаноидов, индуцируемых в растении различными биотическими и абиотическими стрессами, и ферменты, участвующие в их превращениях.

Многие стресс-индуцируемые феенилпропаноиды классифицированы как ФА. Они включают птерокарпаны (глицеоллины), изофлаваны, пренилированные изофлавоноиды (киевитон), стильбены, псоралены, кумарины, 3-деоксиантоцианидины, флавонолы (квертицин, камферол) и ауроны. Уровень этих соединений возрастает вокруг места инфекции до концентраций, которые являются токсическими для патогенов в опытах in vitro. Количество салициловой кислоты у табака, огурцов и арабидопсиса увеличивается в ответ на инфекцию, облучение УФ-радиацией и повышенную концентрацию озона в воздухе. Как будет показано ниже, помимо антимикробного действия, свойственного салициловой кислоте, последняя является элементом сигнальной системы, которая приводит к приобретению локальной и системной устойчивости.
Совершенствование современной биохимической техники позволило открыть новые ферменты фенилпропаноидного биогенеза. Так были открыты сульфтрансферазы, каждая из которых катализирует сульфатацию специфического флавоноидного гидроксила. Установлено также, что в тканях растений присутствуют высокоспецифичные изофлавоноидные пренилизотрансферазы.
Хотя связь фенилпропаноидов со стрессовыми факторами была установлена давно, долгое время оставалось неясным, в каких именно клетках они синтезируются. Было только известно, что фенилпропаноидные ФА накапливаются около места инфицирования. Установлено, что под воздействием УФ-лучей антоцианы и другие флавоноиды накапливаются в верхних эпидермальных клетках растений. Однако не было ясно, синтезируются ли эти соединения в клетках эпидермиса или транспортируются туда из прилегающих клеток. С использованием гибридизационную и иммунолокационную технику показано, что флавоноиды, белки халконсинтетазы, а также транскрипты ферментов ФАЛ, халконсинтетазы и 4-кумаран: CoA лигазы накапливаются вокруг места инфекции листьев петрушки, зараженной непатогенным для нее видом Phytophthora megasperma.
Субклеточные сайты фенилпропаноидного биосинтеза до сих пор служат предметом дискуссий. Многие фенилпропаноиды аккумулируются в вакуолях, обычно в виде глюкозидов или конъюгатов. Последние затем могут быть вовлечены в транспорт через тонопласт.
Некоторые из основных ферментов фенилпропаноидного пути биосинтеза описаны как цитоплазматические (растворимые), но имеются серьезные свидетельства того, что они связаны с мембранными структурами. Предполагают, что некоторые растворимые ферменты образуют на поверхности мембран «метаболоны» или метаболические кластеры. Интермедиаты фенилпропаноидного обмена быстро передвигаются от одного фермента к другому, транспортируются внутрь мембран и попадают в вакуоль. Вышеописанная модель относится к простым фенилпропаноидам, тогда как пренилтрансферазы, которые участвуют в синтезе пренилированных птерокарпанов и фуранокумаринов, связаны с мембранами пластид.
Во многих видах растений, особенно у бобовых, такие ключевые ферменты, как ФАЛ и халконсинтетанза, кодируются семейством генов. До сих пор не ясно, является ли такое кодирование отражением различных форм ферментов в метаболических компартментах, или в стрессовых ситуациях необходимо столь большое количество фенилпропаноидов, что его может обеспечить лишь семейство генов. ФАЛ является тетрамерным ферментов, вследствие чего экспрессия многих кодирующих генов (по крайней мере четырех) в сочетании с возможной посттрансляционной модификацией может приводить к образованию гетеротетрамерных форм, которые будут по разному реагировать на различные стимулы. Изоферментные формы имеются и у халконсинтетазы.
Поскольку защита растений по своей природе мультикомпонентна, нелегко определить, какое именно соединение и в какой концентрации может защитить растение. К несчастью, растения, которые исследуются в качестве моделей ФА-ответа, такие как соя, люцерна, зеленые бобы и петрушка, не являются идеальными объектами для классического и мутационного картирования, тогда как арабидопсис, удобный для молекулярных и генетических исследований, не образует флавоноиды и фуранокумарины, характерные для упомянутых видов.
Первой прямой демонстрацией потенциальной значимости ФА в защите растений была интродукция в табак из винограда гена стильбенсинтетазы, Чужой продукт гена оказался способным переключать субстрата халконсинтетазы на синтез стильбеновых ФА — ресвератролов, в результате чего растение приобрело устойчивость к возбудителю серой гнили Botrytis cinerea. Однако, имеются данные, согласно которым отдельные индивидуальные ФА не могут играть существенной роли в защите, так, исследование мутанта арабидопсиса, дефицитного по индольному ФА камалехину, показали, что этот ФА не является фактором устойчивости к авирулентному штамму Pseudomonas syringae, однако, задерживает рост вирулентного штамма той же бактерии.
Анализ трансгенных растений табака с уменьшенным уровнем фенольных соединений показал, что скорость развития Phytophthora parasitica в них значительно выше, чем в контрольных. У трансгенных растений превращение триптофана в триптомин приводило к уменьшению фенилаланинового пула, снижению уровня хлорогеновой кислоты, связанных фенолов и, как следствие, возрастанию поражаемости фитофторой.
Лигнин
Лигнин является комплексом полимеров, формирующихся из смеси простых фенилпропаноидов. Oн образуется при вторичном утолщении клеточных стенок, вследствие чего межклеточное пространство импрегнируется этим фенольным полимером. Лигнинофикация представляет собой ферментативную дегидрогенизацию и последующую радикальную конденсацию кумарилового, кониферилового и синапиловаго спиртов. Соотношение этих строительных блоков различается у разных видов растений. Лигнин двудольных растений содержит два главных типа мономеров G и S субъединиц, названных гваяцил и сирингил. Первый образуется из кониферилового спирта, второй — из синапилового. В разных лигнинах соотношение G and S субъединиц различно.
Лигнин ковалентно связан с целлюлозой и гемицеллюлозами, а также с гликопротеинами клеточных стенок, возможно, белками, обогащенными оксипролином. Неполностью сформированный лигнин, вероятно, играет роль в ограничении роста гиф гриба. Локальные лигниновые вкрапления иногда встречаются в протоплазме на ранних стадиях грибной инфекции несовместимыми паразитами. Интересно, что лигнин, индуцированный инфекцией, часто отличается по составу от лигнина здоровых тканей. Быстрое накопление предшественников лигнина часто сопровождается локальным возрастанием de novo ФАЛ, пероксидазы и перекиси водорода, которые принимают участие в синтезе и конденсации составляющих лигнина. Обработка растительных тканей ингибиторами ФАЛ подавляет образование лигнина и способствует проникновению инфекции в ткани растений.
Важную роль в образовании лигнина играет пероксидаза, активность которой, как и активность ФАЛ, возрастает при механическом повреждении тканей и при заражении. Пероксидаза 1) осуществляет полимеризацию коричных спиртов в лигнин; 2) формирует прочные сшивки между целлюлозой, пектином гликопротеинами клеточных стенок и лигнином; 3) участвует в заживлении ран — отложении водонепроницаемого барьера из полимеризованных алифатических и ароматических соединений (суберинизации ткани); 4) участвует в катаболизме (разложении ауксинов). В геномной библиотеке Arabidopsis обнаружено более 70 генов, кодирующих пероксидазу и близкие к ней по структуре белки. В растительной клетке пероксидаза локализована в разных компартментах и существует в нескольких изоформах:
1. Катионные (pH 8,1-11). Катализируют образование перекиси водорода из НАДН и воды. Локализованы в центральной вакуоли. Обладают активностью ИУК-оксидазы и регулируют уровень ауксинов в клетке.
2. Слабо анионные (pH 4,5-6,5). Локализованы в клеточных стенках. Умеренно активные лигнификаторы. Осуществляют суберинизацию ран.
3. Анионные (pH 3,5-4,0). Локализованы в клеточных стенках. Осуществляют лигнификацию и сшивки полисахаридов клеточных стенок.
Активность регулируется уровнем ауксинов.
Возрастание локальной лигнификации является одним из механизмов, ограничивающих распространение вирусов по тканям растений. Установлено, что в реакцию СВЧ листьев табака, пораженного ВТМ, помимо ФАЛ и пероксидазы вовлекается также 4-гидроксилаза коричной кислоты, CoA лигазы и о-метилтрансферазы, содержание которых резко возрастает вокруг зоны некроза.