Структура R-белков

Изолированные продукты исследованных R-генов (R-белки) имеют в своем составе несколько структур (рис. 8.1).
Крупный С-концевой участок. Содержит большое число повторяющихся последовательностей с высоким содержанием аминокислоты лейцина (leucine rich repeads — LRR). Каждый повтор состоит из 23-24 аминокислот, а число повторов в разных R-белках варьирует от 14 до 37. Эта структура, повторяемая во многих белках эукариот, осуществляет белковые взаимодействия, т. е. служит рецептором, связывающимся с лигандом — белковым элиситором патогена. LRR структура свиного ингибитора рибонуклеазы PRI — часть β-цепи с консенсусной последовательностью xxLxx (L — лейцин, х — любая аминоксилота), в которой остаток лейцина входит в гидрофобный кор, а другие аминокислоты составляют гидрофильную поверхность, связывающуюся с лигандом. LRR-структура имеет большие возможности для генетических реорганизаций вследствие точковых мутаций, делеций, инверсий, вызванных, в частности, описанными выше случаями эктопической рекомбинации, что приводит к изменениям рецепторых свойств молекулы. Экспериментально показано, что мутации, меняющие реакцию на заражение вирулентными расами патогенов, картируются в этой структуре.

LRR области белков Cf9, Cf4, Cf2 и Cf5 томатов имеют сайты, к которым через гликозильные связи присоединены углеводы, вследствие чего R-белки, обусловливающие устойчивость томата к Cladosporium fulvum, — гликопротеины, и их углеводные остатки также могут обеспечивать связывание с лигандами. Таким образом, посттрансляционные модификации также увеличивают вариабельность рецепторных молекул.
Большую роль в увеличении генетического разнообразия семейств генов устойчивости могут играть и разрывы кодирующей области ДНК, вызванные внедрение мобильных элементов. Например, в локусе риса Ха21 идентифицированы транспозоны Truncator и Retrofit, способные вызывать разрывы генов и образование самостоятельных рамок считывания.
По-видимому, гипервариабельная структура участков ДНК, кодирующих домены из повторов, содержащих лейцин, является наиболее подходящей для эволюционного генерирования новых последовательностей.
Это, в частности, показано при определении соотношения несинонимических (Kа) и синонимических (Ks) замен оснований ДНК. Замены отдельных нуклеотидов могут приводить к возникновению триплетов, кодирующих новую аминокислоту (несинонимические замены), или же, вследствие вырожденности генетического кода, к сохранению ранее кодируемой аминокислоты (синонимические замены). В большинстве участков ДНК синонимические замены превышают несинонимические (Ka:Ks < 1), ибо вторые (нонсенс- или миссенс мутации) снижают приспособленность. Однако в генах, кодирующих главный компонент гистонесовместимости человека, поверхностные антигены паразитов и LRR-домены R-белков растений соотношение Ka:Ks составляет для разных R-белков 1,5-2.
На С-терминальном конце LRR-области некоторых R-белков, локализованных в мембране, имеется трансмембранный домен TM), обеспечивающий прохождение через мембрану. Известны также R-белки, у которых LLR-область связана с фактором регуляции транскрипции WRKY.
Область, обеспечивающая связывание с нуклеотидами (Nucleotide binding Site — NBS), состоит из трех доменов (NB-ARC-1-ARC-2): киназы 1a — петли, связывающей фосфат (Р-петли), киназы 2, связывающей ион металла, необходимого для реакции переноса фосфора, и киназы 3а, аргинин которой обеспечивает взаимодействие с пуриновым основанием АТФ.
NBS — сигнальная область, обладающая функцией АТФ-азы. Гидролиз АТФ сопровождается изменение конформации NB домена, вследствие чего он может активировать киназы или сигнальные G-белки. Область NBS гомологична генам Ced нематоды Caenorhabditis elegans и Apaf-1 человека — регуляторам активности протеазы — каспазы, которая является фактором программированной смерти клеток — апоптоза. Первый этап индукции апоптоза — соединение белка Apaf-1 с цитохромом с, обусловленное гидролизом связи Apaf-1 с АТФ, после происходит образование апоптосомы и трансдукция апоптозного сигнала. Динамическое равновесие между АТФ и АДФ-связями NB-LRR белка обеспечивает его активную и неактивную конформации: в соединении с АТФ конформация активна, а гидролиз АТФ возвращает белок в покоящееся состояние.
Супер-скрученная область (CC) состоит из альфа-спиралей с повторяющимися последовательностями в N-терминальном участке. Способствует формированию спирализованных структур, обеспечивающих димеризацию или специфическое взаимодействие с другими белками. R-белки, находящиеся в интактной клетке в виде мономеров, при заражении могут с участием СС-области формировать гомо- или гетеро-олигомеры, взаимодействующие с элиситором, или, наоборот, при заражении происходит диссоциация ранее имевшихся олигомеров. Возможна также гетеродимеризация R-белка с другими белками. В аминотерминальной области СС-домен у различных R-белков соединяется с одним из двух дополнительных доменов. У пасленовых растений — это SD (solanaceous domain). У других растений СС-область R-белка соединена с областью, способной связываться с ДНК (zinc-finger BED-домен).
Область гомологии с цитоплазматическим доменом Toll-белка дрозофилы и рецептором интерлейкина I млекопитающих, названная TlR (Toll/Interleukin I Resistance). Рецепторный белок Toll контролирует дорзовентральную поляризацию эмбрионов дрозофилы, а также играет роль в ядерной локализации фактора Dif (dorsal related immunity factor), который активизирует защитные свойства жирового тела. В частности, белок Toll регулирует синтез антигрибного пептида дрозофилы дрозомицина.
Интерлейкин-1 — один важнейших цитокинов (межклеточных передатчиков сигналов), активирующих иммунные клетки млекопитающих, благодаря взаимодействию с находящимися на поверхности клеток рецепторами. Связывание обоих рецепторных белков сопровождается активацией серин/треониновых протеинкиназ. TIR-область растительных R-белков имеет сходные функции.
Отчетливыми сигнальными свойствами обладает серин/треониновая протеинкиназа (РК), обнаруженная у некоторых R-белков. Она является фактором активации транскрипции и одновременно — активатором других сигнальных путей.
Вне зависимости от наличия или отсутствия дополнительных доменов большинство R-белков относится к одной из двух групп 1) T1R-NBS-LRR; 2) CC-NBS-LRR (табл. 8.1).

R-белки, представленные в группе 3 таблицы, имеют внеклеточный LRR-гликопротеин, заякоренный в мембране С-концом молекулы. Как вытекает из описанного выше, эти белки могут быть рецепторами, связывающими элиситоры (мембранная локализация LRR-области), но не способны выполнять функции передачи сигнала. Возможно, эти белки ассоциированы с мембранными протеинкиназами или же их короткий цитоплазматический N-концевой домен сам может взаимодействовать с протеинкиназами.
Продукт гена Pto, напротив, являясь внутриклеточной серин/треониновый протеинкиназой, не способен к выполнению рецепторных функций, т. е. постулированная двухдоменная структура R-белков у томата как бы разделена между двумя факторами устойчивости к разным паразитам. Однако, трансформация дрожжевого генома генами Pto томата и avr-Pto псевдомонады показала, что их продукты после автофосфорилирования белка Pto могут непосредственно взаимодействовать. Взаимодействие осуществляется через область белка AvrPto, названную GINE-мотив, которая локализована на гибкой петле, обеспечивающей взаимодействие с другими белками.
Для изучения эффекта суперпродукции белка Pto кодирующий ген был трансформирован в геном томата. В результате такой манипуляции палисадные клетки мезофилла некротизировались. Одновременно наблюдалась аккумуляция салициловой кислоты, PR-белков, отложение каллозы, лигнификация клеточных стенок, т. е. метаболические эффекты, характерные для СВЧ-реакции. Растения стали устойчивыми к вирулентным расам Pseudomonas syringae pv tomato, Xanthomonas vesicatoria и Cladosporium fulvum, т. е. приобрели неспецифическую устойчивость. Таким образом, перепродукция внутриклеточной протеинкиназы приводит к трансформации специфической устойчивости в неспецифическую.
С геном Pto сцеплен ген Prf. Его продукт имеет области LRR, NBS и LZ (как белки группы 4), а также длинную область с двумя прямыми повторами, не гомологичную известным белкам. По-видимому, действие белков Pto и Prf в зараженной клетке скоординировано.
R-белок риса Ха-21 имеет все необходимое для соответствия описанной выше модели (рис. 8.1). Наружу выдвинута рецепторная LRR-область, а внутри клетки находится участок, имеющий структуру серин/треониновой протеинкиназы и способный к внутриклеточной трансдукции сигнала.
R-белки из групп 1 и 2 имеют рецепторные области и сайты трансдукции сигнала, но внутриклеточная локализация этих белков не соответствует ранее высказанным гипотезам о мембранном расположении рецепторов. Некоторые R-белки (N-белок табака, придающий устойчивость к BTM MLA10 белок ячменя — фактор устойчивости к Blumeria graminis f. sp. hordei, Rx белок картофеля, придающий устойчивость к ХВК) наряду с цитоплазматической локализацией могут находиться и в ядерном компартменте, т. е. способны мигрировать между ядром и цитоплазмой. Для вирусов, белки которых синтезируются внутри хозяйских клеток, эндоцитная локализация R-белков (в частности, продукта гена N) естественна. Бактериальные элисисторы могут проходить внутрь растительной клетки с помощью экскреторной системы III-го типа. Механизмы взаимодействия большинства грибных элиситоров с внутриклеточными рецепторами не ясны. В редких случаях отмечено непосредственное взаимодействие грибного элиситора с R-белком. Например, продукт Avr Pi-ta (нейтральная цинк-металлопротеаза) Magnoporthe grisea взаимодействует с LRR доменом белка риса Pi-ta в дрожжевой двухгибридной системе, причем белок мутантного аллеля, который не обеспечивал устойчивость растения к заражению, не взаимодействовал с элиситором. Поскольку белок Pi-ta локализован внутри клетки, соответствующий ему Avr-белок паразита должен транспортироваться в клетки из межклетного пространства, в котором находится продуцент. В большинстве других исследованных систем специфического взаимодействия не обнаружено. Например, элиситорные avr-белки Cladosporium fulvum связываются с клетками и протопластами как устойчивых, так и восприимчивых линий томата. Следовательно, у томата имеется неспецифических рецептор, связывающий внеклеточные белки патогена без индукции СВЧ-реакции. Полагают, что активизация клеточного сигнала происходит после взаимодействия элиситора с гетеродимером, состоящим из R-белка и неспецифического рецептора или, что более вероятно, из R-белка и протеинкиназы (с плазматической мембраной связано несколько типов киназ).
Также сиринголиды, синтезирующиеся под контролем гена avrD Pseudomonas syringae pv. tomato, вызывают СВЧ-реакцию только у сои, имеющей ген Prg4, но связываются с 34 кДа белком, который есть как у устойчивых, так и у. восприимчивых растений. Многие (но не все) гены устойчивости ячменя к мучнистой росе, находящиеся в локусе Mla, требуют для проявления специфической устойчивости наличия двух несцепленных генов — Rar1 и Rar2.
О том, что специфические взаимодействия паразитов с растениями более сложны, чем простое взаимодействие генопродуктов, постулированное правилом «ген-на-ген», свидетельствуют и опыты по изменению вирулентности штаммов Puccinia graminis tritici, обработанных Х-лучами, на почти изогенных линиях пшеницы. Были получены мутанты, изменившие реакцию на заражение с 0-3 на 4 одновременно у линий, имеющих различные Sr-гены (2, 3, 5, 7, 8 и даже 9 разных генов). Следовательно, помимо генов системы «ген-на-ген», пшеница имеет гены, продукты которых необходимы для экспрессии разных avr-генов паразита и Sr-генов растения.
Для объяснения этих фактов была предложена «guard» model. Модель утверждает, что элиситоры в норме функционируют как факторы вирулентности (несут супрессорные свойства). Мишенями элиситоров патогенов могут быть белки, участвующие в защитных функциях или нормальном метаболизме. R-белок соединяется с этим комплексом и поворачивает клеточный метаболизм в сторону защитных реакций. Как было показано, перепродукция Pto-белка повышает неспецифическую устойчивость растений к разным патогенам. Связывание Pto с AvrPto (показано в дрожжевой двух-гибридной системе) направлено на снижение защитного потенциала зараженной клетки, т. е. AvrPto является исходно фактором, бактериальной патогенности. Однако, продукт сцепленного с Pto гена Prf (LRR-NBS-LZ) узнает комплекс Pto-AvrPto и включает путь, ведущий к защитным реакциям.
Другой пример: Avr1 белок бактерии Pseudomonas syringae pv. maculicola связывается не C R-белком RPM1 Arabidopsis thaliana, а с белком RIN4, который принимает участие в нормальной жизни растения (необходим для роста всходов, функционирования меристем и цветения). Этот pathogenicity target (PT) белок после соединения с элиситором фосфорилируется и приобретает способность к взаимодействиям типа «белок — белок» (с R-бел-ком, который играет роль сторожевого РТ-белка, защищающего клетку от повреждений, вызванных инфекцией).
Из представленного выше материала можно сделать несколько важных выводов.
1. Гипотетическая структура R-белков, предложенная на основании изучения феноменологии взаимоотношений растений и паразитов (модели Альберсхейма и др.) оказалась частным случаем, и не соответствует многих исследованным R-белкам.
2. Большинство исследованных R-белков составлены комбинацией нескольких сходных блоков; их структура не отражает таксономических связей как между растениями, так и между их паразитами. Гомологичные R-белки описаны у растений, принадлежащих к разным порядкам; они придают специфическую устойчивость к вирусам, бактериям, грибам, нематодам, насекомым. Это говорит о том, что, во-первых, они возникли давно, до расхождения растений по современным таксонам, и, во-вторых, они первично выполняли не защитные, а иные внутриклеточные функции. Показано, например, что внеклеточный LRR-участок белка Ха-21 риса подобен продуктам генов erecta и clavata арабидопсиса, которые определяют форму и размеры цветков. Белок Pto томата гомологичен цитоплазматическому домену продукта гена гаметофитной несовместимости капусты SRK (кстати, гаметофитная самонесовместимость, как и устойчивость к патогенам, фенотипимчески выражается как некротический отклик на появление определенных генопродуктов). Экспрессия другого гена из семейства S-генов самонесовместимости капусты, SFR2, также кодирующего синтез рецепторной протеинкиназы, резко усиливается при поранении и инфильтрации фитопатогенных или сапротрофных бактерий, т. е. наряду с предотвращением самоопыления имеет и функции защиты от инфекции. Однако, хотя большинство генов устойчивости (и кодируемых ими белков) имеют сходные структуры (состоят из одинаковых блоков), это не доказывает еще общности их происхождения. Например, исследование структуры двух генов Rpg1 Glycine max и RPM1 Arabidopsis thaliana, имеющих сходное строение (NBS-LRR) и узнающих один и тот же белок Pseudomonas syringae, показало гомологию только в консервативных сайтах и отсутствие ортодологии. Структура этих генов свидетельствует скорее в пользу конвергентной эволюции, нежели общего происхождения.
3. Подтверждены данные о том, что один и тот же ген может контролировать устойчивость к разным патогенам. Например, ген томата Mi контролирует устойчивость к нематоде и тле, аллели гена PRR8/HRT Arabidopsis thaliana придают устойчивость к оомицету Peronospora parasitica и вирусу.
4. На молекулярном уровне подтверждены данные о кластерном расположении генов устойчивости. Каждый исследованный ген (Cf, М, N, Pto, Ха-21 и др.) представляет собой сложный локус, кодирующий несколько структурно сходных или идентичных белков. Такая структура возникла вследствие описанных выше явлений эктопической рекомбинации (неравного кроссинговера и др.), обусловленных наличием внутри или по краям генов прямых и обратных повторов. Например, локусы Cf4 и Cf9 томата состоят из двух тандемно дуплицированных генов, однако, наряду с функционально активными последовательностями (Cf4, Cf9) имеются гомологичные им, но не вызывающие СВЧ-реакции гены, названные Hcr (homologues Oadosporium resistance). Опыты с транспозонным мутагенезом показали, что инактивация некоторых Hcr-генов приводит к потере устойчивости по отношению к отдельным штаммам С. fulvum, которые, следовательно, продуцируют в растение специфичные для Hcr-продуктов белки. Рекомбинации в локусе устойчивость кукурузы к ржавчина Rp1 сопровождается появлением новых устойчивых фенотипов. Высокая гомология между локусами H и L льна, контролирующими устойчивость к ржавчине, свидетельствует об их возникновении из одного предшественника. Однако, поскольку эти локусы расположены в разных хромосомах, их возникновение может быть обусловлено межгенными рекомбинациями.
Причинами образования семейств генов могут быть также дупликации с последующим возникновением структурных и даже функциональных различий. Так, по-видимому, возникло семейство Pto-генов томата, включающее FEN-гены, которые определяют чувствительность к инсектициду фентионину, а не устойчивость к бактерии. Подобно множественным генам иммуноглобулинов у млекопитающих, такая структура способна быстро реагировать на возникновение новых рас и видов паразитов.
Общее число локусов, контролирующих R-белки, очень велико. В небольшом геноме Arabidopsis обнаружено более 150 R-локусов, распределенных по всем хромосомам. Из них около 60 % кодируют структуры типа TIR-NB-LRR и 40 % — LZ-NB-LRR. В геноме других растений R-локусов значительно больше.