Генетика сигналлинга

В процесс транскрипции сигналлинга защитного ответа растения вовлечено более 1500 факторов транскрипции. Мутационный анализ позволил идентифицировать некоторые гены, регулирующие трансдукцию сигнала в клетке. Эти гены получили название RDR (Required for Disease Resistance). У томата идентифицировано 4 несцепленных гена Rcr1, Rcr2, Rcr3 and Rcr5 (Required for Cladosporium fulvum resistance). Rcr3 контролирует синтез цистеиновой протеазы, которая секретируется в апопластное пространство. Для индуцирования СВЧ у томатов, имеющих ген устойчивости Cf2, необходимо участие белков Rcr3 (цистеиновая протеаза) и avr2 (ингибитор цистеиновых протеаз). Отсюда следует, что Cf2 — сторожевой (guard) белок, узнающий взаимодействие avr2 с Rcr3 и индуцирующий СВЧ. Rcr3 не влияет на устойчивость, контролируемую другими Cf-генами; мутации по остальным генам вызывают частичное снижение устойчивости. У ячменя функциями RDR обладают гены Ror1 and Ror2 (необходимы для выражения устойчивости геном mlo) and Rar1 (кодирует низко-молекулярный белок с высоко консервативным сайтом, связывающим Zn2+) and Rar2 (участвуют в генерации окислительного взрыва при защитных реакциях, обусловленных наличием гена Mla).
У Арабидопсис для проявления защитных функций генов, имеющих домен TIR, необходим ген Eds1 (enhanced disease susteptibility). Его продукт, как и другого гена, PAD4 (phytoalexin deficient) — липаза триацил-глицерина, участвует в СК-сигнальном пути (с участием салициловой кислоты). Для функционирования R-генов, имеющих LZ-домен, необходимо участие продукта гена Ndr1 (No disease resistance) — низкомолекулярного, основного белка, интегрированного в мембрану, а также гена PBS2. Действие первого из них происходит на самых ранних этапах трансдукции сигнала и обусловлено сопряжением процессов генерации ROS и SA-продукции. В то же время продукты таких генов Арабидопсис, как PBS3, NPR1, SlD1, SID2 and EDS5, необходимы для СК-сигналлинга независимо от структуры R-белков. В отличие от гена PAD4, кодирующего регуляторный компонент аккумуляции салициловой кислоты (СК), Sid-белки непосредственно участвуют в синтезе СК. Интересны функции белка Npr1 (nonexpressor of PR-genes), который играет двойственную роль; он участвует как в СК-сигнальном пути, так и в путях, независимых от СК, требующих жасмоновой кислоты (ЖАК) и этилен-обусловленного сигнального пути (подробнее об этом ниже). Перепродукция Npr1 делает растение устойчивым даже к вирулентным расам патогенов. Продукт этого гена имеет последовательность, свидетельствующую о ядерной локализации белка, и последовательность, характерную для мембранных белков анкиринов, обеспечивающих белок-белок взаимодействия. В частности Npr1 взаимодействует с семейством факторов транскрипции TAG. Используя конъюгацию с зеленым флуоресцентным белком (GFP), была установлена ядерная локализация белка Npr. Важную роль в сигналлинге, связанном с СК, играют две аминотрансферазы, кодируемые генами ALD1 (AGD2-like defense responce protein) и AGD2 (aberrant growth and death). Мутации первого гена приводят к редукции в накоплении CK и делают арабидопсис восприимчивым к Pseudomonas syringae, а второго — наоборот, повышают аккумуляцию CK и устойчивость. Оба белка имеют области высокой гомологии, но проявляют аминотрансферазную активность в противоположных направлениях, что, по-видимому, и объясняет противоположное влияние этих белков на процессы в зараженных растениях. Во всяком случае на ранних этапах индукции синтеза CK необходима несбалансированность аминокислот.
Таким образом, различные сигнальные участки R-белков индуцируют неодинаковые начальные этапы трансдукции (при одинаковых конечных этапах), как это показано на рис. 8.7.

Значительно более существенные различия сигнальных путей обусловлены воздействием разных патогенных факторов. Несмотря на наличие общих компонентов, таких как активные формы кислорода (АФК), защитные реакции в ответ на заражение расоспецифическими биотрофными паразитами с одной стороны и неспецифическими некротрофами, насекомыми, а также на механические повреждения, с другой стороны, протекают разными сигнальными путями. Выше было показано, что сигналлинг, вызванный активацией R-белков у Арабидопсис и других растений расоспецифическими элиситорами, связан с синтезом СК. Впрочем, связь между типом паразитизма и индукцией того или иного пути (через CK или ЖАК) прослеживается не всегда. Кроме того, есть патогены, индуцирующие оба пути.
При заражении Arabidopsis некротрофным паразитом Alternaria brassicola сигналлинг связан с синтезом ЖАК и этилена. Microarray анализ показал, что один и тот же фактор транскрипции (ERF1) регулирует экспрессию многих генов, необходимых для синтеза этилена и ЖАК. В то же время белок целлюлозосинтетаза ингибирует синтез как этилена, так и ЖАК. Мутант по гену целлюлозосинтезы cev1 продуцирует этилен и МеЖАК конститутивно, т. е. ингибирование синтеза клеточной стенки индуцирует экспрессию этих фитогормонов. Для активации защитных реакций важна экспрессия генов PDF1.2 (PIN) and COI1 (JAR), зависимых от наличия ЖАК, в то время как мутации в генах NPR и NahG, не оказывают влияния на протекание защитного ответа. Ген COI1 Arabidopsis кодирует белок, содержащий область, богатую лейциновыми повторами и F-бокс, селективно связывающийся с репрессорными белками и активирующий гены, необходимы для синтеза жасмоната. Для индукции генов, связанных с синтезом жасмоната, необходима также митоген-активная протеинкиназа 4 (МРК4).

CK и ЖАК сигнальные пути интерферируют друг с другом. В ранних работах было показано, что CK или ее ацетилированное производное аспирин ингибируют экспрессию ЖАК в томатах под влиянием поранения. CK повышает уровень ключевого фермента биосинтеза ЖАК синтетазы оксида аллена, стимулируя формирование предшественника ЖАК оксофитодиеновой кислоты (ODPA), но ингибирует конечный шаг ЖАК биосинтеза (рис. 8.8). С другой стороны ЖАК-зависимая экспрессия гена PDF1.2 подавляет накопление СК, которая, в свою очередь, репрессирует PDF1.2. Эта репрессия не проявлялась в генотипе, несущем мутации по генам cpr6 (constitutive expressor of PR genes) и NPR. Таким образом, в процессе СК-сигналлинга продукт гена NPR1 или какие-то компоненты, образующиеся после него, играют роль негативного регулятора сигнального пути, вызванного ранением. Ключевой фактор, регулирующий протекание защитных реакций по CK или ЖАК путям, является фактор транскрипции WRKY70, экспрессия которого активируется CK и репрессируется ЖАК. Этот фактор действует после синтеза сигнальных молекул CK и ЖАК, являясь активатором СК-индуцированных генов и репрессором ЖАК-индуцируемых генов (рис. 8.9). Есть данные об интерференции между путями трансдукции сигнала, индуцируемыми CK и этиленом. CK ингибирует активность 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты — ключевого энзима в синтезе этилена.