Трансгеноз белка оболочки вирусов

Одним из первых вирусных генов, перенесенных в растения табака, был ген структурного белка оболочки (СБО) ВТМ. С помощью гетерологичных промотеров была осуществлена экспрессия этого гена в клетках растений табака. В этих экспериментах трансгенные растения табака, с высоким уровнем экспрессии СБО ВТМ, оказались более устойчивы к заражению суспензией ВТМ, чем к инокуляции препаратами РНК-ВТМ. Было высказано предположение о том, что одним из возможных механизмов устойчивости в данном случае может быть блокирование процесса диссоциации белка оболочки вирионов ВТМ, который необходим для высвобождения вирусной РНК и запуска начальных этапов инфекционного процесса. Успешное заражение трансгенных растений препаратами РНК BTM объясняется, помимо отсутствия в данном случае, стадии диссоциации, еще и тем, что межклеточный транспорт вирусной РНК, в этой системе, не нуждается в наличии белка оболочки.
Блокирование первичных стадий инфекционного процесса подтверждено в экспериментах по заражению протопластов различных типов клеток табака. Экспрессия СБО-гена BTM в протопластах эпидермальных клеток приводит к возникновению устойчивости этих протопластов к заражению ВТМ. Использование же промотеров, специфически направляющих экспрессию гена СБО в мезофильных клетках, не приводит к устойчивости протопластов этих клеток к заражению ВТМ.
Прямое доказательство гипотезы о механизме СБО-индуцированной устойчивости трансгенных растений к BTM получено в экспериментах с м-РНК β-глюкуронидазы (GUS), которую инкапсулировали в белок оболочки ВТМ. Такие ВТМ-подобные частицы (псевдовирионы) были использованы для инокуляции протопластов трансгенных и нетрансгенных Табаков. Уровень экспрессии GUS м-РНК в протопластах трансгенных линий табака, несущих СБО-ген ВТМ, был значительно ниже экспрессии в протопластах нетрансгенных растений. Это однозначно можно объяснить только блокированием процесса отделения СБО от GUS м-РНК в клетках, синтезирующих большое количество структурного белка оболочки ВТМ.
Дальнейшие исследования механизмов устойчивости растений к вирусам, обусловленной экспрессией генов СБО в трансгенах [СБО(+) растения], показали наличие в данном случае многоуровневой эшелонированной защиты. При инокуляции растений препаратами вирусов, вызывающих пятнистости на листьях, во всех случаях наблюдается снижение среднего удельного количества инфекционных пятен на один лист у СБО(+)-трансге-нов по сравнению с СБО(-)-линиями того же сорта. Из этого следует, что одним из возможных сайтов реализации противовирусной защиты может быть барьер создаваемый на первых ступенях развития инфекционного процесса. Таким образом экспрессия генов СБО в клетках трансгенных растений, по-видимому, приводит к взаимодействию СБО со структурами растительной ткани, ответственными за устойчивость к проникновению вирусной инфекции.
Сравнительное изучение последующих стадий развития инфекционного процесса в СБО(+)- и СБО(-)-растениях табака проводилось следующим образом. Были подобраны концентрации BTM в инокулюмах таким образом, чтобы они давали примерно одинаковое удельное число некрозов на лист СБО(+) и СБО(-) растений. Анализ среднего количества вируса в каждом инфекционном пятне показал, что существенной разницы по этому показателю между СБО(+) и СБО(-) линиями нет. Иммунологический анализ сегментов листьев, вырезанных из областей между инфекционными пятнами, однако, выявил, что в случае СБО(+)-растений накопление вируса в этих частях листьев достоверно меньше, чем в случае СБО(-)-растений. Это позволяет сделать вывод о том, что экспрессия генов ВТМ, кодирующих СБО, в растениях табака индуцирует возникновение второго защитного барьера на уровне распространения вирусов в листовой ткани.
Для проверки влияния СБО на транспорт BTM по сосудистой системе был проведен прививочный эксперимент. Фрагмент трансгенного растения с СБО был привит на ВТМ-восприимчивое нетрансгенное растение. Оказалось, что транспорт BTM через привитый сегмент подавляется.
Это подтверждает предположение о блокировании механизмов распространения вируса по сосудистой системе трансгенных растений, экспрессирующих ген СБО. Возможно, однако, что передвижение BTM по сосудам сопровождается чередующимися процессами ассимиляции и диссимиляции вирионов. В этом случае блокирование транспорта вируса по сосудистой системе может быть вторичным следствием ингибирования диссимиляции вирионов.
Дополнительные доказательства, подтверждающие гипотезу о блокирующем действии генов вирусных СБО на стадии диссимиляции вирионов, основаны на результатах экспериментов с вирусом мозаики люцерны (BMЛ). Однако в этом случае механизмы устойчивости более сложны, чем в случае с устойчивостью против ВТМ. У линий, имеющих низкий уровень экспрессии генов BMЛ, кодирующих СБО, устойчивость наблюдалась только при заражении ВМЛ-вирионами. В противоположность этому, у трансгенных линий, экспрессирующих мутантный СБО или большие количества СБО дикого типа, устойчивость против ВМЛ имела место при заражении и препаратами РНК, и вирионами. Как и в случае с ВТМ, зависимость устойчивости от типа инокулюма позволяет предположить, что устойчивость против ВМЛ действует, по крайней мере, на двух уровнях. На одном уровне может иметь место ингибирование диссимиляции вирионов при низком уровне экспрессии СБО. Второй уровень устойчивости, который проявляется у линий с мутантным СБО или с высоким уровнем экспрессии гена СБО дикого типа, может включать в себя любые взаимодействия СБО, необходимые для инфекционного цикла вируса. Это могут быть взаимодействия с вирусной РНК, необходимые для сборки вирионов или репликации вируса, или взаимодействия СБО с рецепторами растения-хозяина.
Устойчивость против Х-вируса картофеля (ХВК) также оказалась эффективной при заражении и РНК-инокулюмом, и вирионным инокулюмом. Как и в случае устойчивости к ВМЛ, здесь может иметь место блокирование всех стадий инфекционного процесса, необходимых для репликации и транспорта XBK в инфицированном растении. Есть основания предполагать, что взаимодействие синтезируемого трансгенным растением СБО с сайтом начала сборки XBK может приводить к возникновению устойчивости. У потексвирусов начало сборки происходит на 5'-конце вирусного генома, так что взаимодействие со СБО может блокировать трансляцию вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая кодируется на 5'-конце открытой считывающей рамки. Возможно, однако, также, что устойчивость к XBK обусловлена ингибированием межклеточного транспорта, для которого СБО оболочки является необходимым фактором.
Суммируя изложенные данные, можно сделать следующие выводы относительно механизмов защиты, реализующихся в трансгенных растениях, экспрессирующих ген белка оболочки вируса:
1. В СБО(+)-растениях блокирование инфекции происходит на стадии, предшествующей синтезу минус цепи вирусной РНК.
2. Уровень защиты СБО(+)-растений табака значительно выше по отношению к ВТМ, чем к РНК ВТМ. Эта защита обусловлена синтезом белка оболочки BTM в клетках трансгенных растений и не связана с синтезом m-РНК — транскриптов СБО. Аналогичная ситуация имеет место и в случае с трансгенными растениями, несущими ген белка оболочки вируса мозаики люцерны.
3. На уровень защиты СБО(+)-трансгенных растений влияет не только экспрессия гена белка оболочки, но и способность этого белка образовывать внутриклеточные вирусоподобные агрегаты.
4. Прививка стеблей СБО(+) растений на проростки СБО(-) растений табака приводит к индукции устойчивости к системной инфекции ВТМ, при этом не предотвращается возможность развития первичных стадий инфекции.
Логично было бы предположить, что помимо вирусных структурных белков оболочки существуют и другие белки, экспрессия генов которых в растениях могла бы приводить к возникновению устойчивости к вирусным инфекциям. Рассмотрим свойства некоторых из таких белков, представляющих интерес как в теоретическом плане, поскольку могут быть использованы в качестве инструмента для изучения механизмов вирусоустойчивости, так и в практическом плане, поскольку полученные транс-гены сельскохозяйственных культур могут представлять конкретный практический интерес.