Хитиназы и глюканазы

Известно большое число растительных белков, способных в условиях in vitro подавлять рост грибов. Неизвестно, однако, какая часть из этих белков реально включена в защитные процессы, возникающие в растении в ответ на грибную инфекцию. Тем не менее, появившаяся возможность изучения экспрессии отдельных генов в растении позволяет с одной стороны исследовать роль этих белков в иммунитете растений, а с другой стороны использовать антигрибные белки в создании трансгенных растений с повышенной устойчивостью к грибным болезням.
Наиболее известными антигрибными белками являются хитиназы и β-1,3-глюканазы. Эти ферменты катализируют гидролиз соответственно хитина и β-1,3-глюкана — основных компонентов клеточной стенки большинства грибов. Известно 4 класса (I-IV) растительных эндохитиназ. Из них, по крайней мере, 3 найдены в тканях табака. Из различных видов растений выделено три основных класса β-1,3-эндоглюканаз. Ферменты, относящиеся к I классу гидролаз, локализованы в растительных вакуолях и являются потенциальными ингибиторами роста многих грибов. Отмечен ярко выраженный синергизм хитиназ и β-1,3-глюканаз I класса, т. е. при смешивании разбавленных растворов гидролаз, каждый из которых не обладал фунгитоксичностью, получается смесь, активно блокирующая рост грибов. Гидролазы II класса локализованы на внешней стороне клеточной мембраны и не обладают антигрибными свойствами.
Перенос гена вакуолярной хитиназы фасоли был осуществлен в геном табака и рапса. Экспрессия этого гена контролировалась конститутивным 35S — промотором ВМЦК. Результатом экспрессии гена хитиназы была частичная устойчивость трансгенных растений к возбудителю ризоктониоза Rhizoctonia solani. В этом случае с помощью цитохимических методов было показано, что механизм защиты обусловлен лизисом грибных гиф, внедренных в ткани растения-хозяина. В аналогичных экспериментах конститутивная экспрессия гена β-1,3-глюканазы из сои в клетках табака также индуцировала частичную устойчивость трансгена к R. solani. Анализ механизмов устойчивости в данном случае показал способность трансгенных растений более энергично высвобождать глюкановые фрагменты клеточных мембран, обладающих элиситорной активностью.
Таким образом, экспрессия генов хитиназы и глюканазы повышает устойчивость трансгенных растений к грибным патогенам, но механизм защиты в том и в другом случае различен. Учитывая обнаруженный в опытах in vitro синергизм действия этих ферментов, была разработана экспериментальная схема совмещения двух целевых генов в одном трансгене.
В качестве целевых генов использовались: ген RCH10 риса, кодирующий щелочную хитиназу и ген AGLUl люцерны, кодирующий кислую β-1,3-глюканазу (рис. 14.6). Экспрессия обоих генов активно индуцируется в ответ на механические повреждения растительной ткани, либо под действием микробных элиситоров или в ответ на внедрение инфекции. Для корректного сравнения защитного эффекта экспрессии отдельных генов и совместной экспрессии обоих целевых генов была использована схема, согласно которой каждая из генно-инженерных конструкций вводилась в отдельные растения табака. Определялась степень устойчивости монотрансгенов к одному и тому же патогену. Затем были получены половые гибриды между монотрансгенами и определялась устойчивость гибридов, несущих оба целевых гена.

При тестировании монотрансгенов на устойчивость к С. nicotianae в обоих случаях отмечалось повышение устойчивости трансгенов по сравнению с исходными нетрансгенными линиями табака. Устойчивость гибридов, полученных от скрещивания монотрансгенов, оказалась значительно выше устойчивости родительских монотрансгенов. Механизм защиты у гибридов носил сложный характер и выражался в задержке появления первых видимых симптомов и последующем снижении как количества инфекционных пятен, так и среднего размера этих пятен.
При искусственной инокуляции конидиями С. nicotianae степень развития болезни у гетерозиготных Т2-гибридов была достоверно ниже по сравнению с гомозиготными линиями табака, несущими по одному из целевых генов. Комбинация 1n хитиназы и 1n β-1,3-глюканазы оказалась более эффективной по сравнению с монотрансгенами, несущими двойные дозы целевых генов (соответственно, 2n хитиназы или 2n 1,3-глюканазы).
Высокая степень защиты при комбинировании генов RCH10 хитиназы и AGLU1 глюканазы была также обнаружена при инокуляции гибридных трансгенных Табаков возбудителем листовой пятнистости Thanatephorus cucumeris (базидиальная стадия Rhizoctonia solani). Комбинация этих двух генов, по-видимому, придает трансгенному растению устойчивость к широкому спектру грибных болезней. Это подтвердилось на модели трансгенных томатов, в геном которых были интродуцированы по два тандемно расположенных генов хитиназы и глюканазы. Экспрессия такой комбинации генов приводила к устойчивости трансгенных томатов к Fusarium oxysporum.
Синергизм действия конститутивно экспрессируемых генов хитиназы и глюканазы обусловлен, по-видимому, двойным действием этих ферментов: разрушением клеточной стенки грибного патогена и высвобождением из клеточных мембран фрагментов хитиновой и глюкановой природы, обладающих элиситорной активностью.