Другие методы иммунодиагностики фитопатогенов


Иммунофлуоресценция
С появлением гибридомной технологии, открывшей возможности создания моноклональных антител и позволившей повысить чувствительность и специфичность иммунофлуоресценции (ИФ), этот, известный с сороковых годов прошлого века, метод стал вновь использоваться в иммунодиагностике фитопатогенных микроорганизмов. Детекция фитопатогенов посредством ИФ осуществляется с помощью антител, с которыми химически связаны молекулы флуоресцирующих красителей, такие как изотиоционат флуоресцеина или родамина. Прямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA) проводится с конъюгатами антиген-специфичных антител, а непрямой, подобно TAS-ELISA, с использованием несущих флуоресцентную метку вторичных антител. Антигены, присутствующие в нанесенном на слайд образце (споры или другие пропагулы патогена, срезы растительной ткани, бактериальные клетки и т. п.), связывают меченые антитела во флуоресцирующий иммунный комплекс, который наблюдают под флуоресцентным микроскопом. ИФ может давать и количественный результат, если подсчитывать под микроскопом число флуоресцирующих единиц. Ho такой подсчет — очень долгая и трудоемкая процедура, которая сильно ограничивает производительность количественной оценки. Однако, число анализируемых образцов можно увеличить, если применить автоматизированную систему микроскопирования с соответствующей компьютерной программой. Альтернативной возможностью является проведение иммунохимической реакции в лунках микропланшета и измерение эмиссии образцов с помощью специальных приборов.
Как и в случае ИФА, компоненты образца могут блокировать иммунохимическую реакцию или искажать результаты ИФ-анализа. Во-первых, растительные ткани и почва имеют собственную флуоресценцию. Во-вторых, наряду с аутофлуоресценцией, иногда происходит неспецифическая сорбция антител на частицах образца, и наблюдаются перекрестные реакции с другими микроорганизмами. Эти ограничения следует учитывать при разработке диагностических методик на основе ИФ.
В настоящее время ИФ нашла свое практическое применение как метод детекции обитающих в почве видов грибов и оомицетов из рода Fusarium и Phytophthora, как один из способов определения локализации патогенов в растении и диагностики некоторых бактериальных болезней.
Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг (Вестерн блоттинг) является высокочувствительным способом исследования белков и применяется для диагностики фитопатогенных микроорганизмов и вирусов по их белковым антигенам. Он объединяет два метода анализа протеинов — электрофорез и иммунодетекцию с помощью антител. Такая комбинация обеспечивает высокую разрешающую способность метода за счет электрофоретического разделения белков и обнаружения среди них антигена(ов) с помощью гомологичных антител или антисывороток. При соблюдении оптимальных условий анализа, используя иммуноблоттинг, в образце удается обнаружить менее 1 нг целевого антигена.
Принципиально, методика проведения иммуноблоттинга включает три следующих стадии. Сначала анализируемые белки разделяют в полиариламидном геле с ДСН. После этого их можно окрасить и сравнить с эталоном, если таковой имеется, или с маркерами молекулярной массы. Затем на гель помещают нироцеллюлозную мембрану, перенос белков на которую происходит за счет диффузии или с помощью электроблоттинга. Далее следует нанесение меченных ферментом mABs, pABs, антител без ферментной метки, или просто гомологичной антисыворотки (в двух последних случаях для обнаружения связавшихся антител применяют антивидо-вые конъюгаты) и проведение ферментативной реакции. Таким образом, заключительная стадия иммуноблоттинга фактически является вариантом твердофазного ИФА.
Вестерн блоттинг позволяет обнаружить индивидуальный белок в смеси, содержащей множество других белковых веществ. С его помощью идентифицируют вирусы, содержащиеся в растительных экстрактах, и устанавливают их наличие в клетках насекомых-переносчиков. Например, иммуноблоттинг оказался подходящим методом для обнаружения и идентификации вирусных возбудителей в пораженных растениях пшеницы, кукурузы, чеснока и винограда как при индивидуальной, так и при смешенной инфекции.
Следует, однако, иметь в виду, что в результате электрофореза с ДСН получают белки в денатурированном состоянии, которые не распознаются антителами, специфичными к нативным белкам. Ho если в распоряжении исследователя имеются антитсыворотки против входящих в состав белков пептидов, метод может быть использован для выявления серотипов у вирусов растений и установления степени родства между их штаммами.
Иммунологический анализ в тканях растений
Метод иммунных отпечатков (Tissue Blot Immunoassay — TBI) позволяет с большой точностью локализовать антигены фитопатогенных организмов (главным образом, вирусов и в меньшей степени грибов, бактерий и фитоплазм) в растительных тканях. Тест представляет собой перенос антигенов исследуемого образца с поверхности среза растительной ткани на поверхность нитроцеллюлозной мембраны путем блоттинга с последующим выявлением иммобилизованных на мембране антигенов антителами, несущими ферментную метку. Такой перенос возможен благодаря высокой сорбционной емкости нитроцеллюлозы по отношению к макромолекулам и вирусным частицам. Процесс по сути аналогичен переносу белков Вестерн блоттингом после электрофореза с геля на мембрану, но сама процедура более проста. Для того чтобы получить отпечаток растительной ткани на нитроцеллюлозе, свежий срез ткани своей поверхностью на доли секунды слегка прижимают к мембране. Более сильный контакт является нежелательным, поскольку высокое или продолжительное давление может повредить поверхность среза и исказить отпечаток. TBI может быть прямым или непрямым, в зависимости от использования для локализации возбудителя вирус-специфичных или видоспецифичных антительных конъюгатов (или протеина А).
В отличие от ELISA, пероксидазные конъюгаты являются, как правило, неподходящими для TBI, т. к. во многих растительных тканях присутствуют активные пероксидазы. Щелочная фосфатаза — более подходящий фермент при использовании данного метода. Следующее условие состоит в том, что конечный окрашенный продукт ферментативной реакции должен быть нерастворимым и оставаться на мембране, в том месте, где произошло иммунохимическое взаимодействие. Для того чтобы TBI был применим в тканях, содержащих большие количества эндогенных пигментов, мешающих локализации антигенов, используют хемилюминисцентные субстраты и рентгеновскую пленку.

  • Анализ состава жирных кислот при идентификации фитопатогенных бактерий
  • Разновидности метода ПЦР
  • Методы с использованием ПЦР
  • Методы гибридизации нуклеиновых кислот
  • Быстрые ELISA-тесты
  • Некоторые примеры практического использования ELISA
  • Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии
  • Иммуноферментный сорбционный анализ - ELISA
  • Методы диагностики, основанные на взаимодействии антител с антигенами фитопатогенов
  • Современные методы диагностики фитопатогенов

  •  

    • Яндекс.Метрика
    • Индекс цитирования