Разновидности метода ПЦР

ПЦР с применением обратной транскрипции (RT PCR)
Для обнаружения и идентификации таких фитопатогенов как вироиды и РНК-содержащие вирусы классический вариант ПЦР-анализа оказывается неприменимым, поскольку Taq-полимераза не способна катализировать синтез ДНК на РНК-матрице. Поэтому при диагностике данных патогенов используют еще один фермент, называемый РНК-зависимая ДНК-полимераза, или обратная транскриптаза (reverse transcriptase). Реакция с участием обратной транскриптазы приводит к образованию одноцепочечной кДНК, фрагмент которой затем амплифицируется с участием Taq-пoлимеразы.
ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR — RT PCR; ОТ-ПЦР) успешно применяется для детекции поражающих растения вирусов и вироидов, а так же наличия вирусов у тлей-переносчиков. Хорошо известно, что обнаружение и идентификация фитоплазм и вироидов, присутствующих в растениях в чрезвычайно малых количествах — весьма сложная задача, для решения которой могут быть использованы гибридизационный анализ (фитоплазмы) или возвратный гель-электрофорез (вироиды). Эти методы на несколько порядков менее чувствительны, чем ОТ-ПЦР.
При диагностике бактерий, грибов или оомицетов с помощью ОТ-ПЦР, ориентированного на определение мРНК, удается не только продемонстрировать их присутствие в растении, но и получить информацию об их жизнеспособности.
Отметим, что процесс обратной транскрипции может протекать с участием еще одного фермента — Tth-полимеразы, выделенного из другой термофильной бактерии (Thennus thermopilus). В диагностике вироидов и РНК-содержащих вирусов Tth-полимераза может, в силу некоторых своих особенностей, использоваться одновременно как для синтеза однонитевой ДНК, комплементарной РНК патогена, так и для амплификации целевого фрагмента ДНК.
ПЦР с вложенной парой праймеров (Nested PCR)
В русскоязычной научной литературе встречаются также такие названия данного варианта ПЦР, как «вложенная» ПЦР, метод гнездовой полимеразной цепной реакции или нестед-ПЦР.
ПЦР с вложенной парой праймеров является одной из модификаций метода, весьма часто привлекаемой для идентификации патогенов растений. Характерной особенностью данного варианта ПЦР является то, что в реакции последовательно участвуют две пары праймеров, при этом вторая пара праймеров участвует в амплифицикации фрагмента ДНК внутри продукта, полученного после завершения цикла реакций с парой внешних праймеров. Существуют две технические альтернативы проведения ПЦР с вложенной парой праймеров. Согласно первой, в реакционной пробирке после проведения 15-30 циклов амплификации получают базовый фрагмент ДНК с участием внешних праймеров. Затем переносят аликвоту содержимого в другую пробирку, содержащую реакционную смесь с внутренними праймерами, взаимодействующими с нуклеотидными последовательностями внутри полученного фрагмента, и проводят вторую амплификацию (реаплификацию), также включающую 15-30 циклов. Альтернативный вариант нестед-ПЦР предполагает подбор такой температуры отжига для первой стадии, при которой вложенная пара праймеров не взаимодействует с ДНК. В этом случае температуру реамплификации обычно поддерживают на 10-15 °C ниже, чем при реакции с внешними праймерами.
С точки зрения применения в целях диагностики фитопатогенов «вложенная» ПЦР имеет как преимущества, так и недостатки. К достоинствам метода, прежде всего, относятся высокая чувствительность и уменьшение числа побочных продуктов реакции, а также усиление специфичности при амплификации целевого фрагмента, благодаря чему достигается более точная идентификация патогена. Перенесение продукта после первого цикла реакций во вторую пробирку может способствовать снижению концентрации ингибиторов полимеразной реакции, которые иногда присутствуют в препарате. Однако, с другой стороны, в этом случае возрастает вероятность получения ложно-положительных результатов из-за возможного загрязнения неспецифическими продуктами амплификации. Поэтому предпочтительно использование варианта с проведением обеих стадий анализа в одной и той же пробирке.
Метод гнездовой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией успешно используется для идентификации фитоплазм, а также других фитопатогенов, включая бактерии (например, для обнаружения и идентификации Erwinia amylovora в растениях до появления симптомов бактериоза).
Мультиплексная ПЦР (Multiplex PCR)
При мультиплексной (мультипраймерной) ПЦР в одной и той же реакционной среде происходит процесс коамплификации нескольких ДНК-овых матриц с участием нескольких пар праймеров. Это позволяет одновременно диагностировать несколько патогенов в одном эксперименте. Важно убедиться, что праймеры для мультиплекс-ПЦР не комплементарны друг к другу, и подобрать условия анализа, которые подходят для равно-эффективного отжига всех участвующих в реакции праймеров, чтобы обеспечить одинаковый выход амплифицируемых продуктов. Кроме того, при анализе результатов методом электрофореза необходимо, чтобы ПЦР-продукты, образующиеся при амплификации ДНК из разных патогенов, имели различный размер. В настоящее время анализы на основе мультиплекс-ПЦР наиболее часто применяют в фитопатологии при комплексной диагностике фитоплазм, нематод, а также вирусов и вироидов.
ПЦР в комбинации с ELISA
ПЦР-ELISA (Immunocapture PCR — ПЦР с иммунным захватом) является примером совместного использования иммунохимических и молекулярных методов для диагностики фитопатогенов. Иммуноферментный анализ может быть введен как на завершающей, так и на начальной стадиях детекции патогена. В последнем случае образец, подлежащий исследованию (например, экстракт, содержащий детектируемый вирус) добавляют в микропробирку или в лунки микропланшета, на поверхности которых сорбированы антитела, специфически связывающие вирусные частицы. На следующей стадии в щелочных условиях в присутствии подходящего детергента из этих частиц освобождают вирусную ДНК или РНК и проводят, соответственно, ПЦР или ОТ-ПЦР. Обычно ПЦР-ELISA усиливает специфичность и чувствительность диагностики фитопатогенов. Он также полезен, если в образце присутствуют компоненты, ингибирующие полимеразную реакцию, поскольку снижает или устраняет их влияние. Данный метод был успешно использован для диагностики некоторых патогенных для растений грибов, бактерий, вироидов и вирусов (например, для обнаружения тобамовируса гибискуса, выявления гриба Didymella bryonia среди других возбудителей аскохитоза огурца, детекции бактерии Е. amylovora в плодах груши при их естественном заражении и др.).