Фитоалексины

Честь открытия фитоалексинов (ФА) принадлежит немецким фитопатологам Мюллеру и Боргеру. Согласно их определению, ФА являются антибиотиками растительного происхождения, которые синтезируются в растении de novo в ответ на микробную инфекцию и участвуют в механизмах болезнеустойчивости растений. Иное определение ФА дает американский фитопатолог Дж. Куч, который полагает, что ФА — это низкомолекулярные антимикробные вещества, которые накапливаются в растениях в ответ на инфекцию или стресс. Быстрота и количество их накопления в растении, определяются освобождением их (или их близких предшественников) из конъюгатов или синтезом de novo, а также деградацией ферментами растений и микроорганизмов.
Долгое время ФА рассматривались как главный механизм устойчивости растений, однако, в настоящее время помимо ФА в растениях обнаружены и другие защитные ингредиенты, такие как PR-белки, ингибиторы протеиназ, активные формы кислорода, богатые оксипролином гликопротеины, механические барьеры на пути инфекции и другие иммунные ответы. Это, конечно, не означает, что ФА утратили свое значение, однако их защитное действие следует рассматривать на фоне мультикомпонентного ответа растительной клетки.
В своих классических исследованиях, на основе которых и было предсказано существование ФА, Мюллер наносил на поверхность среза клубня картофеля суспензию спор несовместимой расы возбудителя фитофтороза в виде креста. Через сутки всю поверхность среза инфицировали совместимой расой того же патогена. Спустя несколько дней на всей поверхности среза, кроме участков ткани, предварительно инфицированных несовместимой расой, где развивалась реакция СВЧ, появлялся мицелий гриба. Внешне это выглядело как черный крест некротизированной ткани на белом фоне мицелия гриба. В защищенных тканях ингибировалось развитие не только совместимой расы фитофторы, но и возбудителя фузариоза и некоторых других патогенов.
В конце 50-х гг. XX в. Мюллер разработал классический метод получения и оценки ФА. В семенные впадины бобов вместо удаленных семян помещали инфекционные капли, содержащие взвесь спор патогена (или непатогена) гороха. Через определенный период времени в инфекционные капли (диффузаты) из тканей растений выделялось фунгитоксическое вещество, которое не образовывалось, если семенные камеры содержали воду. На основании этих опытов ФА были определены как соединения, образующиеся в результате взаимодействия двух метаболических систем — хозяина и паразита и ингибирующие развитие последнего. Преимущество данного методического приема заключалось в том, что используется неповрежденная ткань, т. е. в каплю не попадают метаболиты, образующиеся при механическом повреждении клеток, и отсутствует кутикула, препятствующая взаимному обмену метаболитами между прорастающими спорами паразита и клетками растения.
Метод, предложенный Мюллером, вскоре принес ощутимые результаты.
В 1960-1962 гг. австралийцы Круикшанк и Перрин изолировали из инфекционных тканей гороха ФА, названный пизатином, и идентифицировали его структуру. Вслед за тем был охарактеризован фазеоллин из фасоли, капсидиол из перца (суспензию спор гриба-индуктора помещали в половинки разрезанных плодов) и другие ФА.
Список элиситоров, которые способны вызвать образование ФА, весьма велик. Так, более 200 соединений, микроорганизмов и физиологических стрессов могут вызвать накопление пизатина в горохе, фазеоллина и киевитона в фасоли, глицеоллина в сое. Возможно, что эти соединения вызывают временное нарушение метаболизма растений, химически выражаемое как возникновение сигнала тревоги. Такие сигналы могут инициировать каскад событий, приводящих к синтезу и накоплению ФА.
К настоящему времени охарактеризовано около 350 ФА у растений из 30 семейств. Большая их часть принадлежит к семейству бобовых (около 130 ФА), вследствие использования метода Мюллера для их выделения. Основное число ФА изолировано из двудольных растений, но охарактеризованы и некоторые ФА однодольных: такие как ФА риса, кукурузы, сорго, ячменя, овса, пшеницы, лука, лилий. ФА изолированы из листьев, стеблей, корней и плодов растений, хотя они не всегда синтезируются во всех зараженных органах. ФА являются липофильными соединениями, локализованными вокруг места инфекции. Из-за разнообразия их структуры (рис. 5.15, 5.16) трудно судить о механизмах их антимикробной активности.

Фенилпропаноидные ФА приурочены к растениям из семейств бобовых, пасленовых, вьюнковых, зонтичных. Известна некоторая структурная специфичность ФА, отражающая таксономическое положение их продуцентов. Так, изофлаваноидные ФА, в основном, сосредоточены в растениях из семейства бобовых, но их нет у пасленовых; наоборот, сесквитерпеноидные ФА присущи пасленовым, но не обнаруживаются у бобовых. Что касается структурной специфичности ФА у растений внутри одного семейства, то, например, норсеквитерпеноидный спирт ришитин обнаружен в картофеле и табаке, но не в перцах, тогда как сесквитерпеноидный ФА капсидиол присутствует в табаке и перце, но не в картофеле.
Образование ФА тесно связано с реакцией СВЧ, поэтому, координируя реакцию СВЧ с целью контроля за развитием болезни, можно управлять и образованием ФА. Мертвые (некротизированные) клетки, образующиеся в результате реакции СВЧ, несут особую функциональную роль в явлениях устойчивости, поскольку они являются резервуаром для накопления ФА. Сами по себе мертвые клетки вряд ли могут остановить развитие патогена, но они являются местом складирования или вместилища ФА. Поэтому, чтобы судить о защитной роли ФА как антигрибного барьера на пути распространения инфекции, надо рассчитывать их количество не на единицу веса инфицированной ткани, в которой присутствуют как живые, так и погибшие клетки, а на число некротизированных клеток. В таких клетках ФА накапливаются в чрезвычайно высоких, антигрибных концентрациях, которые вряд ли могут выдержать живые растительные клетки.
Что заставляет перемещаться ФА из живых клеток, где они или их близкие предшественники образуются, в мертвые, некротизированные, где они накапливаются, не известно. Возможно, накопление ФА в некротизированных клетках обусловлено еще и тем, что системы деградации ФА там подавлены. Иными словами, присутствие ФА в мертвых клетках как бы саморегулируется, поскольку ФА в некрозе инактивируют систему их собственной деградации, способствуя, тем самым их накоплению.
Большую роль в антигрибной активности ФА играет пренилирование.
Так, потеря фунгитоксичности в результате гидроксилирования указывает на то, что неполярная боковая цепь и грает важную роль в проявлении активности некоторых изофлаваноидных и сесквитерпеноидных ФА. По-видимому, пренилирование происходит на конечных этапах биосинтеза ФА.

Главные пути биосинтеза, с помощью которых образуются предшественники большинства ФА, — это шикиматный, ацетатно-малонатный и ацетатно-мевалонатный (рис. 5.17). Биогенез ФА часто связан с активизацией фермента на ключевом этапе биосинтеза. Этот фермент может регулировать ранние этапы биогенеза, но может участвовать и в конечных этапах. Примером является биосинтез сесквитерпеноидных ФА картофеля. Оксиметилглютарил CoA редуктаза (ОМГР) является регуляторным ферментом ранних этапов ацетатно-меваловатного пути (рис. 5.17). Активность этого фермента возрастает как в механически пораненных, так и в инфицированных клубнях. Ho изофермент, образующийся в ответ на разрезание клубня, отличается от соответствующего фермента, возникающего в ответ на инфекцию. В последнем случае возрастает также сесквитерпенциклазная активность (се-сквитерпенциклаза, СЦ), которая катализирует превращение франезилпирофосфата в циклический предшественник терпеноидных ФА. Одновременно уменьшается скваленсинтазная (CC) активность, которая приводит к образованию тритерпеноидных стеринов и стероидных гликоалкалоидов. Оба фермента функционируют на этапе разветвления ацетатно-мевалонатного пути (рис. 5.18). Ферменты, регулирующие конечные этапы синтеза и превращения ФА, также находятся под контролем различных систем сигнальной трансдукции. Так в клубнях картофеля, обработанных элиситором из препарата клеточных стенок Phytophthora infestans, накапливается больше ришитина, чем любимина. Однако, в присутствии ингибитора фермента НАДФ-оксидазы дифенилйодина, в индуцированных клубнях, наоборот, накапливается больше любимина, чем ришитина. Поскольку НАДФ-оксидаза — ключевой фермент при генерации окислительного взрыва, полагают, что именно АФК обеспечивают метаболизм любимина в ришитин.

Предшественники некоторых ФА могут образовываться при комбинации от одного до трех биогенетических путей, что представляет дополнительные возможности для регуляции их биосинтеза. Например, для синтеза предшественника фазеоллина необходимо участие нескольких путей биосинтеза (шикиматного, малонатного). В большинстве случаев регуляция осуществляется на транскрипционном уровне, поэтому, как видно и представленных в табл. 5.2 данных, ингибиторы транскрипции (актиномицин D) и трансляции (бластицидин) подавляют образование ФА и, соответственно, устойчивость к развитию патогена в зараженных тканях.
Однако при синтезе ФА могут также иметь место и отдельные элементы посттрансляциенного контроля. Дж. Куч полагает, что образование ФА не всегда связано с их синтезом de novo, а их накопление иногда происходит в результате гидролиза конъюгатов. Так в сое в больших количествах конституционно присутствует изофланоидный коньюгант даидцеина, являющегося близким предшественником глицеоллина. При несовместимой комбинации сои с возбудителем фитофтороза коньюгант даидцеина быстро гидролизуется, в результате чего накапливается глицеоллин и развитие гриба прекращается. В совместимой комбинации гидролиз задерживается, поэтому низкий уровень глицеоллина отмечается уже в зоне прохождения фронта инфекции. Подобные данные были получены и для ФА медикарпина и маакиаина в нуте. Быстрота гидролиза предшественника зависела от концентрации элиситора: при его низком содержании гидролиза глюкозида почти не происходило, в то время как высокие дозы элиситора приводили к образованию глицеоллина. Таким образом, птерокарпановые ФА могут не только синтезироваться de novo, но и возникать из коньюгатов в результате гидролиза последних.

Показателем токсичности химических соединений для грибов служит ЭД50 (концентрация химиката, тормозящая рост колонии на 50 %). ЭД50 ФА для разных грибов колеблется от 10в3 до 10в5 М, т. е. ФА являются достаточно слабыми антигрибными агентами. Доказательств их передвижения в растениях не существует. Однако скорость накопления ФА и их локализация в месте инфекции способствуют поддержанию в растении токсичной для грибов концентрации. Исход взаимоотношений растения и паразита зависит от трех факторов: от количества образовавшегося ФА, скорости его образования и от чувствительности к нему паразита. Степень участия ФА в явлениях устойчивости растений устанавливается на основании многих тестов: антимикробной активности, измеренной в опытах in vitro, скорости их синтеза, локализации в местах развития патогенов, присутствия соединений, влияющих на их антимикробную активность, а также детоксикации ФА ферментами гриба и растения.
ФА играют роль в видовом и сортовом иммунитете (хозяйской и нехозяйской устойчивости). Роль ФА в видовом иммунитете наглядно представлена в табл. 5.3.

Как видно, синтез пизатина в ответ на заражение гороха паразитом злаков Erysiphe (Blumeria) graminis начинается значительно раньше, чем в ответ на заражение «собственным» патогеном E. pisi, пизатин достигает в 25 раз большей концентрации и в 13 раз более токсичен. То есть концентрация пизатина в горохе, зараженном E. graminis, в 50 раз превышает летальную для патогена дозу, а в горохе, зараженном E. pisi, — в 7 раз ниже летальной дозы.
Связь ФА с сортовым иммунитетом показана в табл. 5.4.

Как видно, при заражении всех исследованных сортов авирулентной расой ФА картофеля ришитин и любимин накапливались в концентрациях, на порядок более высоких, чем при заражении вирулентной расой.
В некоторых случаях вещества, присутствующие в зоне инфекции, могут влиять на чувствительность гриба к ФА. Например, включение полярных липидов из гороха в среду роста некоторых грибов уменьшало их чувствительность к пизатину, маакиаину и фазеоллину. Коммерческий фосфатилидилхолин также уменьшал чувствительность к пизатину ряда грибов. Такие стрины, как фитостерин, стигмастерин и холестерин, снижали чувствительность Phytophthora infestans к ришитину и любимину. Таким образом, эффективность ФА, как защитных веществ, зависит от присутствия в среде (в том числе в зараженном растении) соединений, влияющих на антигрибную активность.
По своей антигрибной активности могут заметно отличаться и стереоизомеры ФА. Птерокарпановые ФА имеют как (+), так и (-) стереоизомерию. Большинство бобовых растений накапливает (-) формы за исключением гороха, который образует (+) пизатин, и софоры (Sophora japonica), которая продуцирует как (+), так и (-) маакиаин. Антигрибная активность маакиаина и пизатина к некоторым грибам стереоспецифична. Некоторые патогены, изолированные из люцерны и красного клевера, в большей мере ингибируются (+) маакиаином, чем (-) формой этого ФА. Различия в чувствительности, возможно, зависят от неспособности патогена деградировать (+) изомер. Эти данные сулят перспективы в плане создания растений, продуцирующих один и тот же ФА с различной стерической конфигурацией.
Хотя большинство растений продуцирует ФА по классической схеме, существуют виды (огурцы, дыни, арбузы), образования ФА в которых не установлено, хотя есть все основания предполагать их присутствие.
Одной из возможностей использования ФА для контроля за болезнями является трансформирование в растение генов β-глюканазы и хитиназы, которые не только будут разрушать покровы патогенов, но и продуцировать олигомеры, обладающие элиситорной активностью и вызывающие образование ФА. Другой возможность является трансформирование в растение генов, необходимых для синтеза неродственных ФА. Примером могут быть ФА из моркови, которая невосприимчива ко многим патогенам бобов. Трансформирование в бобы генов синтеза ФА моркови предохранило их от многих бобовых патогенов. Сложность этого приема заключается в том, что для трансформации ФА из одного растения в другое часто бывает необходимо вводить не один, а группу генов, ответственных за синтез ФА.