Ингибиторы ферментов

Ингибиторы протеиназ представляют особую группу белков растений, объединяемую общей способностью образовывать с протеиназами стехиометрические комплексы, что приводит к конкурентному ингибированию каталитической активности. Ингибиторы протеиназ присутствуют в растениях различных таксономических групп. Их особенно много в семенах и других запасающих органах растений, где их содержание может составлять до 5-10 % водорастворимых белков.
Почти все ингибиторы протеиназ из растений представляют собой пептиды или небольшие белки, совсем не содержащие углеводов. Предполагается, что ингибиторы протеиназ устойчивы к действию самих протеиназ, хотя имеются и исключения из этого правила.
Наиболее хорошо исследованы ингибиторы протеиназ злаковых и пасленовых. Из представителей семейства пасленовых наибольшее многообразие форм ингибиторов описано у картофеля. В клубнях этого растения обнаружены ингибиторы, подавляющие активность сериновых, цистеиновых, аспартильных протеиназ и карбопептидаз. Ингибиторы сериновых протеназ на основе общности свойств принято делить на следующие группы родственных белков: семейство ингибитора картофеля I, семейство ингибитора картофеля 11, ингибиторы протеназ семейства Куница (первый кристаллический ингибитор трипсина, выделенный из сои М. Куницем в 1945-1946 гг.).
Наибольшее число работ посвящено изучению сериновых протеиназ семейства картофельных ингибиторов I и II, для которых характерно наличие олигомерной структуры (ингибитор картофеля I состоит из 4-5 субъединиц, ингибитор II является гетеродимером).
Подавляющее большинство белковых ингибиторов сериновых протеиназ действуют по, так называемому, субстратноподобному механизму, суть которого состоит в том, что ингибитор выступает как высокоспецифический субстрат фермента, подвергающийся медленному ограниченному протеолизу.
Первичная структура ингибитора I из картофеля сходна с игибиторами из ряда других растений. Поэтому всех их относят к одному семейству картофельного ингибитора хемотрипсина I, хотя и не все они выделены из картофеля. Представители этого семейства ингибиторов широко распространены в растениях различных таксономических групп.
Ингибиторы сериновых протеиназ сосредоточены в центральной вакуоли. Предполагается, что при перемещении ингибиторов из цитоплазмы в центральную вакуоль происходит их превращения в активные формы в результате ограниченного протеолиза. Так, ингибиторы I и II образуются в результате посттрансляционного ограниченного протеолиза, который осуществляется соответствующими протеиназами.
В клубнях картофеля присутствуют и низкомолекулярные ингибиторы протеиназ. Возможно, что некоторые из них являются продуктами ограниченного протеолиза высокомолекулярных ингибиторов, тогда как другие могут быть непосредственным результатом трансляции.
Многие ингибиторы протеиназ из растений характеризуются «двуглавостью», т. е. каждая молекула такого ингибитора может одновременно связывать две молекулы одной и той же или различных протеиназ по двум реактивным центрам.
В растениях существует большое число ингибиторов протеиназ, что дает дополнительные возможности для их регулирования:
1) ингибиторы протеиназ могут различаться по субстратной специфичности;
2) ингибиторы существуют в различных изоформах;
3) олигомеры ингибиторов протеиназ могут диссоциировать и объединяться в различных комбинациях, причем свойства ингибитора будут зависеть от того, какие олигомеры и в каком сочетании объединяются. Обычно рассматриваются три главные функции ингибиторов протеиназ:
1) ингибиторы протеиназ как запасные белки растений;
2) ингибиторы протеиназ как регуляторы белков или ферментов самого растения;
3) ингибиторы протеиназ как составная часть защитной системы растений.
Естественно, что для нас наибольший интерес представляет защитная функция ингибиторов протеиназ, поэтому остальные функции будут рассмотрены кратко.
1. Выше уже упоминалось, что особенно высокое содержание ингибиторов протеиназ находится в запасающих органах растений — семенах и клубнях, при этом ингибиторы синтезируются на той же стадии развития, что и запасные белки. При прорастании зерна активность ингибиторов снижается и постепенно исчезает. При прорастании клубней картофеля содержание ингибиторов уменьшается до того времени, пока растение не начнет образовывать новые клубни, в которых вновь накапливается ингибитор.
2. Возможно, что главной функцией ингибиторов протеолитических ферментов, является их участие в регуляции собственных протеиназ растений. В большинстве случаев на эндогенные протеиназы растений действуют ингибиторы цистеиновых протеиназ, а не ингибиторы трипсина и хемотрипсина, влияющие на протеиназы микроорганизмов. Имеются указания, что цистеиновая протеиназа, содержащаяся в прорастающих семенах, не только деградирует их белок зеин, но и разрушает ингибитор эндогенной сериновой протеиназы. В белковых телах семян гречихи одновременно присутствуют все элементы протеолиза, т. е. ингибитор и субстрат. Ингибиторы протеаз могут предохранять растения от неконтролируемого протеолиза. Находясь в цитоплазме, они способны защищать белки растительных клеток в случае повреждения внутриклеточных структур и освобождения протеиназ.
3. Ингибиторы протеиназ могут выполнять важную защитную роль в растениях, пораженных микроорганизмами. Так, многие белки-ингибиторы трипсина и хемотрипсина способны подавлять сериновые пpoтеиназы микроорганизмов. Например, в клубнях картофеля присутствует ингибитор I, способный подавлять хемотрипсиновую протеиназу, а ингибитор II (двуглавый) подавляет как трипсин, так и хемотрипсин. Оба ингибитора активно подавляют субтилизин и протеиназы грибов рода Aspergillus.
Показано действие ингибиторов I и II из картофеля на протеиназы, секретируемые в культуральную жидкость Fusarium solani и F. sambucinum. Подавление протеолитической активности может приводить к нарушению способности патогенов поглощать растительные белки, и, соответственно, к подавлению их роста и развития. Ингибиторы трипсина и хемотрипсина непосредственно подавляли рост в культуре некоторых фитопатогенных грибов.
В ряде случаев установлена взаимосвязь между устойчивостью растений к болезням и содержанием у них ингибиторов протеиназ. Такая корреляция имела место между устойчивостью пшеницы к твердой головне и люпина и сои к фузариозу.
При прорастании семян бобовых ингибиторы протеиназ быстро диффундируют в окружающий раствор и, по-видимому, принимают участие в предохранении семян от инфекции на ранних стадиях прорастания.
В клубнях картофеля существуют два главных запасных белка. Это — пататин, составляющий около 40 % всех водорастворимых белков клубней и ингибитор протеиназ II (около 10 %). Пататин обладает липидацил-гидролазной активностью, которая может быть связана с защитой картофеля от фитопатогенов. При поранении клубней картофеля образование патотина в листьях и стеблях прекращается, а системная индукция ингибитора II начинается.
Из семян ячменя был выделен «двуглавый» ингибитор, который содержал независимо действующие центры связывания субтилизина и α-амилазы. Позднее аналогичные бифункциональные ингибиторы были выделены из семян пшеницы, ржи и тритикале. Установлена аминокислотная последовательность для двух ингибиторов эндогенной α-амилазы и субтилизина из пшеницы и ячменя. Молекула бифункционального ингибитора содержит два остатка метионина. Для того чтобы оценить положение остатка, входящего в состав реакционного центра, ингибитор был подвергнут ограниченному протеолизу стафилококковой протеиназой. В результате полностью исчезала активность ингибитора α-амилазы, тогда как активность по отношению к субтилизину сохранялась.
Предполагается, что бифункциональные ингибиторы могут играть существенную роль, как в предотвращении прорастания зерна, так и в защите растений от фитопатогенов. В покоящемся зерне ячменя бифункциональный ингибитор локализован в эндосперме. В процессе прорастания зерна происходит транспорт ингибитора из эндосперема в проросток. По-видимому, бифункциональный ингибитор α-амилазы и субтилизина, с одной стороны, тормозит прорастание зерна при неблагоприятных условиях, а с другой — подавляет активность протеиназ патогенных микроорганизмов.
Существенный вклад в исследование роли ингибиторов протеиназ был внесен работами американского биохимика К. Райан. Было установлено, что простое механическое поранение картофеля или томатов вызывает быстрое накопление ингибиторов протеиназ по всему растению. Накопление ингибиторов протеиназ наблюдалось в томатах после инфицирования Phytophthora infestans. Синтез ингибиторов протеназ происходил после обработки табака препаратом клеточных стенок Р. parasitica. Ответная реакция растений объяснялась образованием в месте повреждения специфического раневого гормона, обозначавшегося как PIIF (proteinase inhibitor — inducing yactor). PIIF был идентифицирован как растворимый, обогащенный остатками уроновой кислоты пектиновый полисахарид с молекулярной массой около 5 KDa. Минимальным фрагментом, который требовался для активности PIIF, оказалась 4-α-D-галактуронозил-D-галакуроновая кислота. Для проявления активности ингибиторов требуется интактное гемиацетальное кольцо и свободная карбоксильная группа при С-6.
PIIF образуется в результате ферментативной деградации клеточной стенки и относится к числу «эндогенных элиситоров». Под воздействием PIIF содержание ингибиторов I и II в листьях пасленовых могло достигать до 2 % от общего количества вновь синтезированных белков. Образовавшиеся ингибиторы были локализованы в вакуолях.
Способность к образованию PIIF под влиянием повреждения была обнаружена у 10 из 23 исследованных видов растений. Больше всего PIIF накапливалось в люцерне, затем — в табаке, томатах, картофеле, землянике, огурцах, тыкве, клевере, конских бобах и винограде. Обнаруженное сходство в индукции PIIF у представителей разных семейств указывает на единые принципы механизмов защиты у растений.
Кроме PIIF образование ингибиторов протеиназ могло быть вызвано пектином цитрусовых, олигоуронидами со степенью полимеризации от 2 до 20, а также растворимыми производными хитина и хитозана. Ингибиторы протеиназ в ряде случаев могут индуцироваться под воздействием абсцизовой кислоты.
Райан предложила гипотетическую схему распространения сигнала индукции биосинтеза ингибитора протеиназ в ответ на поранение насекомыми и заражение фитопатогенами (рис. 5.19). Первый путь, связанный с механическими поранениями, наносимыми насекомыми, индуцируется полипептдом системином, который быстро транспортируется по всему растению, взаимодействуя со специфическими рецепторами. Второй путь связан с заражением патогенами и предполагает индукцию олигоуронидами, которые освобождаются из клеточных стенок растений и взаимодействуют с другими специфическими рецепторами. Излишне говорить, что предложенная схема двух путей индукции ингибиторов протеиназ является гипотетической. Однако в ее пользу свидетельствует тот факт, что специфический ингибитор липоксигеназы подавляет синтез ингибиторов протеиназ, образующихся в ответ на поранение, но не оказывает влияния на накопление ингибиторов под действием олигоуронидов.
Роль ингибиторов протеиназ в процессах патогенеза следует рассматривать очень широко, поскольку они могут регулировать активность ферментов, участвующих в защите: как ингибировать ненужные протеиназы, так и активизировать протеиназы, которые до этого были связаны и, наоборот, связывать протеиназы, которые могли разложить вновь синтезируемые белки.
Ингибиторы ксиланаз
В пшеничной муке были изолированы два типа белков — ингибиторов ксиланаз — XIP-1 (xylanase inhibitor protein 1) и TAXI (Triticum aestivum endoxylanase inhibitor protein), представленный четырьмя изоформами (TAXI-I, TAXI-11, TAXI-III, TAXI-IV). XIP-I полностью ингибирует ксиланазы, принадлежащие семействам 10 (GH10) и 11 (GH11) микробных глюкозид гидролаз. TAXI-I и TAXI-II различаются по специфичности к G11 микробным ксиланазам. Поскольку ни один из этих белков не ингибирует собственные ксиланазы пшеницы, было предположено, что они участвует в защиты от грибных патогенов пшеницы. Однако регуляция экспрессии кодирующих генов оказалась различной. Taxi-I не экспрессировался в цветущих колосьях и листьях, зараженных Fusarium graminearum и Blumeria graminis соответственно; транскрипция Xip-I индуцировалась в листьях, зараженных мучнистой росой, но не в колосьях, зараженных возбудителем фузариоза, а экспрессия генов Taxi-III и Taxi-IV усиливалась и в обеих тканях, зараженных разными патогенами. Различная экспрессия генов семейств XIP и TAXI свидетельствует об их различном участии в системе защиты пшеницы от болезней.