Подавление защитного потенциала растения. Вивотоксины

Гидролитические ферменты, разрушающие клеточную оболочку, для этой цели не годятся, так как, будучи высокомолекулярными соединениями, они не способны мигрировать по растению. Эти ферменты — оружие ближнего боя. Роль веществ, мигрирующих от места инфекции по растению и создающих плацдармы для дальнейшей его оккупации паразитом, выполняют вивотоксины. Это название, предложенное американскими фитопатологами Даймондом и Ваггонером, возникло вследствие методической дискуссии о критериях фитотоксинов микробного происхождения. В первых исследованиях токсических метаболитов грибов растения подвергали воздействию фильтрата жидкой питательной среды, в которой культивировали исследуемый вид гриба. Если обработка фильтратом вызывала такие же симптомы болезни, как и заражение грибом (увядание, некрозы и т. п.), то считалось, что в культуральную жидкость выделяются фитотоксины, которые можно очистить и исследовать. Однако, при длительном росте на искусственной питательной среде происходит автолиз отдельных клеток мицелия и освобождение в среду веществ, которые в норме в растение не освобождаются. Подобные методы изучения привели к ошибкам в установлении химической природы фитотоксинов. Поэтому было предложено в качестве критериев токсина учитывать, во-первых, воспроизводство данным химическим соединением симптомов болезни и, во-вторых, обнаружение его не только в колбе (in vitro), но и в зараженном данным патогеном растении (in vivo).

Вивотоксины неспецифичны, они вызывают повреждения не только хозяина данного паразита, но и видов растений, находящихся за пределами его пищевой специализации. Поэтому вивотоксины относят к факторам неспецифической (горизонтальной) патосистемы.
По химической природе вивотоксины разделяют на несколько групп (рис. 6.4):
1. Органические кислоты, например, щавелевая кислота возбудителя белой гнили Sclerotinia sclerotiorum.
2. Циклические ароматические соединения (кумарины, азотсодержащие алкалоиды и др.). Таковы альтернариевая кислота (продуцент — Alternaria solani), фузариевая кислота (Fusarium oxysporum) и др.
3. Циклические пептиды, состоящие из нескольких аминокислот, замкнутых в кольцо — фазеолотоксин (продуцент Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola), тентоксин A. tenuis (syn. A. alternata) и др.
4. Гликопептиды, такие как токсины Clavibaeter michiganense (возбудитель бактериального рака томатов) и Phoma tracheophylla (возбудитель мальсекко цитрусовых).
5. Полисахариды (токсин бактерий Xanthomonas campestris).
6. Полипептиды, например, цератоульмин — 13 кДа токсин возбудителя голландской болезни ильмов Ophiostoma ulmi.
По механизму действия выделяют несколько групп токсинов.
Ингибиторы ферментов растений
Табтоксин — токсин Р. syringae pv. tabaci — дипептид, соединенный с β-лактамовым кольцом. В зараженном растении протеазы отщепляют активную часть токсина — табтоксинин-β-лактам — ингибитор фермента глютаматсинтетазы. В результате снижения активности фермента накапливается его предшественник аммоний, вызывающий разобщение фосфорилирования, ингибирование фотосинтеза и фотодыхания. Это нарушения обмена проявляются как системный хлороз и задержка роста.
Фазеолотоксин — циклический трипептид Р. savastanoi pv. phaseolicola. В растении протеазы отщепляют активное начало фазеотоксин орнитидин — специфический ингибитор фермента орнитинкарбамоил-трансферазы, которая катализирует конверсию орнитина в цитруллин и аргинин. В зараженных растениях содержание орнитина увеличивается в 100 раз.
Коронатин — токсин многих патоваров Р. syringae, в частности, возбудителя ожога листьев овса Р. syringae pv. coronafaciens. Он вызывает пожелтение листьев табака, ингибирует рост корней пшеницы, повышает активность амилазы и гипертрофию клубней картофеля. По своей структуре коронатин схож с растительным гормоном жасмоновой кислотой, перепродукция которой вызывает сходные симптомы у растений. Вероятно, коронатин замещает жасмоновую кислоту, о роли которой речь будет идти ниже.
Тентоксин — токсин гриба Alternaria tenuis (=A. alternata). Циклический тетрапептид, вызывающий хлороз, вследствие связывания с сопрягающим фактором (CFl) и ингибирования фотосинтетического фосфорилирования.
Мембранноактивные вещества
Очень многие токсины, такие как фузариевая кислота (F. oxysporum), токсины бактерий из рода Clavibacter, токсины многих патоваров Р. syringae (коронатин, сирингомицины), токсины фитопатогенных грибов из родов Rhinchosporium, Cephalosporium, Fusicoccus, Cercospora, Phoma и другие обладают сильным мембранотропным эффектом. Они индуцируют потерю метаболитов из клеток и их некрозы, влияют на трансмембранный перенос ионов и открывают устьица, вызывая увядание растений.
Токсин возбудителя ранней пятнистости листьев картофеля Alternaria solani альтернариевая кислота вызывает деполяризацию мембран и супрессирует реакцию сверхчувствительности клубней устойчивых к фитофторозу сортов картофеля в ответ на заражение Phytophthora infestans.
Генераторы активных форм кислорода
Некоторые фитопатогенные грибы из родов Cercospora, Cladosporium, Alternaria, Elsinoe, Hypocrella образуют циклические соединения (рис. 6.5), для проявления токсичности которых в отношении растений-хозяев требуется свет, т. е. они относятся к группе веществ — фотосенсибилизаторов. В результате абсорбции энергии света фотосенсибилизаторы конвертируются в энергетически активное состояние и приобретают способность при взаимодействии с молекулярным кислородом генерировать его активные формы — радикалы — супероксид (O2), перекись водорода (H2O2), гидроксильный радикал (ОН) и не радикал синглетный кислород (1O2). Все они обладают высокой токсичностью и вызывают повреждения в клетках растений. У Cercospora nicotianae обнаружен ген CRQ1, кодирующий белок, который имеет ДНК-связывающий мотив Cys6Zn2, т. е. является активатором транскрипции. Мутанты по этому гену во-первых, чувствительны к токсину церкоспорину и, во-вторых, производят его на 30-55 % меньше, чем штаммы дикого типа. Полагают что белок Crq1 нужен как для активации генов синтеза церкоспорина, так и для устойчивости к продуцируемым им активным формам кислорода.

Ингибиторы синтеза белка
Генетическую регуляцию синтеза низкомолекулярных вторичных метаболитов, обладающих свойствами вивотоксинов, рассмотрим на примере трихотеценовых токсинов фузариевых грибов. Эти токсины представляют интерес, во-первых, потому, что их продуценты вызывают экономически очень важные болезни пшеницы, ячменя, кукурузы, и, во-вторых, потому, что содержащие токсины растительные продукты токсичны для людей и сельскохозяйственных животных (вызывают потерю аппетита, дерматиты, анемию, геморрагический сепсис, иммуносупрессию). Эти соединения, к которым принадлежит несколько антибиотиков грибного происхождения, ингибируют синтез белка у эукариот.
Биосинтез трихотеценовых токсинов показан на рис. 6.6. Как видно, ключевой фермент, осуществляющий циклизацию фарнезил пирофосфата в триходиен (триходиен синтетаза) контролируется геном Tri5. После серии окислений, изомеризации и вторичной циклизации образуется два класса соединений (А и В), различающихся наличием или отсутствием кето-группы при С-8 атоме трихотеценового скелета, — Т-2 токсин Fusarium sporotrichoides и дезоксиниваленон (ДОН) F. graminearum.

Молекулярные исследования биосинтеза трихотеценовых токсинов начались после того, как был очищен ключевой фермент триходиен синтетаза и с его помощью клонирован ген Tri5. Было обнаружено, что космида, несущая этот ген, комплементирует мутации и по другим генам, влияющим на последующие этапы синтеза трихотеценов. Отсюда сделан вывод о сцеплении этих генов в общем кластере размером 25 тысяч пар нуклеотидов (тпн). Кластеры для обоих видов Fusarium (F. sporotrichoides и F. graminearum) имели высокую степень гомологии, фланкированы одинаковыми генами тирозиназы и полисахарид дезацетилазы и содержат по крайней мере 11 генов, связанных с биогенезом трихоценов (рис. 6.7). Среди них есть биосинтетические гены — Tri4 (Р450 монооксигеназа, осуществляющая гидроксилирование триходиена), Tri3 (15-0-ацетилтрансфераза), Tri11 (Р450 монооксигеназа, участвующая в гидроксилировании С-15) и регуляторные — Tri6 (активатор транскрипции), Tri12 (регулятор выхода трихотеценов из клетки). Ген Tri7 (4-0-ацетилтрансфераза) F. sporotrichoides, у F. graminearum отсутствует, a Tri13 (белок типа Р450) находится в виде псевдогена. По-видимому эти ферменты не необходимы в синтезе токсинов В-типа, поэтому кодирующие их гены утрачены в ходе эволюции.

Роль токсинов в патогенезе разнообразна и до конца не расшифрована. Для многих паразитов установлены выделение токсинов в зараженное растение и их миграция по растению, опережающая миграцию самих возбудителей. Поэтому такие системные симптомы болезней, как увядание и хлороз могут быть обусловлены миграцией токсинов из точки заражения.
Значение токсинов в патогенезе показано с помощью мутантов, лишенных способности их продуцировать (tox-). У фитопатогенных бактерий получены нетоксигенные штаммы с помощью транспозонового мутагенеза (генетическая трансформация клетки мобильным генетическим элементом — транспозоном, который, внедряясь в какой либо участок ДНК, вызывает мутации находящихся там генов). Как правило, такие мутанты вызывают более слабые симптомы болезни и накапливаются в зараженных растениях в значительно меньшей концентрации.
У возбудителя голландской болезни ильмов Ophiostoma ulmi штаммы, не продуцирующие цератоульмин, не только не патогенны, но имеют измененные морфолого-культуральные признаки и медленно растут in vitro. Влияние токсина на морфогенез продуцента обусловлен тем, что цератоульмин относится к семейству гидрофобинов — гидрофобных белков, имеющих морфогенетические функции.
Таким образом, у многих фитопатогенов вивотоксины имеют узко специфичные сайты действия (определенные ферменты); их неспецифичность обусловлена тем, что эти сайты имеются у большинства растений и часто являются ключевыми в метаболизме растений. Некоторые токсины (например, цератоульмин) бифункциональны и наряду с токсичным для растения действиям несут иные функции, которые возможно первичны.