Молекулярная интерпретация генетических данных
Из схемы «ген на ген» Флора, изображенной в виде квадратной сетки, следует, что только при наличии у партнеров двух взаимодействующих доминантных генов наступает реакция устойчивости или несовместимости, в то время как при любых других сочетаниях этих генов будет наблюдаться реакция восприимчивости (совместимости). Комбинацию двух генов, приводящую к несовместимости, называют дефинитивной, а остальные комбинации — недефинитивными. Дефиниция означает определение. Такое обозначение подчеркивает определяющую роль несовместимости, так как последняя во флоровских взаимоотношениях паразита и хозяина возникает при наличии доминантных аллелей взаимодействующих генов, т. е. аллелей, несущих информацию о функционально значимых генопродуктах. Наличие «плюс» функций у генов устойчивости и авирулентности вытекает из теории, ибо если в геномах хозяина и паразита имеется только одна пара дефинитивных генов (например, R3/A3 в приведенной ниже схеме), то, несмотря на наличие многих недефинитивных пар генов будет развиваться реакция несовместимости:
«Плюс» функции генов авирулентности и устойчивости подтверждены многими экспериментами. Флор получил после облучения рентгеновскими лучами спор авирулентной к сорта льна Кото и Леоне расы 1 ржавчинного гриба Melampsora lini, мутанты, вирулентные к сорту Кото. После самоопыления мутантных культур была проверена вирулентность 191 штамма M1. Все они, как и родительский мутант, оказались вирулентными к сорту Кото, но 12 штаммов стали также вирулентными и к сорту Леоне. Результаты наблюдений были интерпретированы следующим образом: Раса 1 гетерозиготна (правильнее — гетероаллельна, ибо клетки ржавчинных грибов содержат по два гаплоидных ядра, гетероаллельность которых фенотипически неотличима от гетерозиготности) по авирулентности к сорту Кото и гомозиготна по авирулентности к сорту Леоне. Поскольку вирулентность рецессивна, эта раса вирулентна к обоим сортам.
Гены авирулентности к сортами Кото и Леоне сцеплены, в результате облучения Х-лучами в ядре, несущем ген авирулентности к сорту Кото, произошла делеция, которая захватила оба сцепленных гена авирулентности (к сортам Кото и Леоне). Споры стали гетерозиготными по делеции и, вследствие наличия рецессивного гена вирулентности к сорту Кото во втором (неповрежденном) ядре дикариона, вирулентными к этому сорту. После инбридинга возникли три типа дикариотических клеток: 1) гомозиготы по гену вирулентности к Кото (вирулентны для Кото и авирулентны для Леоне); 2) гетерозиготы по делеции (также вирулентны для Кото и авирулентны для Леоне) и 3) гомозиготы по делеции (вследствие отсутствия доминантных аллелей генов авирулентности вирулентны для обоих сортов). Из этих данных можно сделать вывод, что ген вирулентности представляет собой неактивный аллель гена авирулентности, фенотипически неотличимый от делеции.
Свидетельство функциональной важности продуктов генов устойчивости получены при специально спланированных для этих целей скрещиваниях линий пшеницы, имеющих гены устойчивости к стеблевой ржавчине Puccinia graminis. Дителосомные линии, у которых отсутствовало хромосомное плечо, несущее ген устойчивости, поражались расами гриба, имеющими дефинитивные к этим генам аллели авирулентности. Таким образом, отсутствие локуса устойчивости фенотипически проявляется как аллель «восприимчивости». На это основании сделано заключение, что аллель «чувствительности» эуплоидов может иметь нефункциональную последовательность ДНК (нонсенс-мутацию) или, если она функционально значима, то ее генопродукт не взаимодействует с продуктом дефинитивного аллеля паразита (миссенс-мутация).
Еще одно свидетельство в пользу «плюс» функций генов устойчивости — температуро-чувствительные (ts) гены, продукты которых функционально активны при оптимальной для данного организма (пермиссивной) температуре, но теряют активность при повышенной (рестриктивной) температуре вследствие конформационных изменений белка. У злаков такие гены впервые наблюдали при круглогодичном выращивании растений в теплице. Было замечено, что некоторые сорта при заражении одними и теми же расами ржавчинных грибов устойчивы зимой, но поражаются летом, когда температура в теплицах повышена. Например, ген устойчивости пшеницы к стеблевой ржавчине Sr6 контролирует реакцию устойчивости (0) на заражение авирулентными расами при температуре 20° и реакцию восприимчивости (3-4) при температуре 26°. Среди ts генов устойчивости наиболее исследован ген N дикого табака Nicotiana glutinosa. При заражении листьев этого табака BTM в пермиссивных условиях (25°) образуются небольшие некротические пятна, число которых пропорционально концентрации вирусных частиц в инокулюме (реакция сверхчувствительности — СВЧ). В клетках листа, прилегающих к некротизированным, имеются частицы ВТМ, не способные распространяться по листу (заблокированы в зоне некроза). Если зараженное растение поместить в условия рестриктивной температуры (35°), то произойдет распространение вируса из мест заражения в окружающие клетки (системное заражение растения). При возврате в пермиссивные условия все участки, в которые успели распространиться вирусные частицы, некротизируются, так что все растение может погибнуть. Поскольку в пермиссивных условиях синтезируется нормальный функционально активный белок, а в рестриктивных — дефектный, то для протекания СВЧ-реакции (несовместимости) необходим активный продукт гена устойчивости, несущий «плюс» функции. Дефект в белке приводит к реакции восприимчивости.
Из генетических данных следует, что взаимодействие продуктов генов устойчивости и авирулентности приводит к несовместимости, в то время как потеря или изменение одним из партнеров (или обоими) дефинитивного гена изменяет реакцию на совместимую. Наиболее простая биохимическая интерпретация этих данных заключается в предположении, что какие-то структуры растения-хозяина, синтезируемые под контролем генов вертикальной устойчивости, узнают структуры или метаболиты паразита, контролируемые комплементарными генами авирулентности как чужие, и запускают защитные реакции. Отсутствие у хозяина узнающей структуры (рецептора) вследствие изменения или потери гена устойчивости или отсутствие у паразита метаболита, связываемого рецептором, вследствие потери или изменения гена авирулентности приводят к тому, что паразит перестает узнаваться хозяином, как чужой, и защитные реакции не включаются (или включаются слишком поздно), и отношения между партнерами становятся совместимыми (рис. 7.1). В процессе формирования гаустория углеводы клеточной стенки паразитического гриба входят в непосредственный контакт с плазмалеммой растения. По предположению американского биохимика П. Альберсхейма при наличии комплементарности в строении углеводных цепочек клеточной стенки гриба и третичной структуры белка плазмалеммы происходит узнавание паразита и включается сигнал к защитным реакциям. Таким образом, доминантные аллели генов устойчивости контролируют синтез рецепторного белка на цитоплазматической мембране хозяина, а доминантные аллели генов вирулентности — синтез ферментов глюкозилтрансфераз, соединяющих в определенном порядке моносахариды и строящих углеводные цепочки в клеточных стенках гриба. Тот факт, что комплементарные гены паразита и хозяина имеют разную степень связи с взаимодействующими продуктами (ген устойчивости — непосредственную, а ген авирулентности — опосредованную, через трансферазы), не должен накладывать ограничения на данную гипотезу. Как было отмечено выше, гены устойчивости и авирулентности различаются и по организации на хромосомах: первые часто образуют серии аллелей, а вторые, как правило, не сцеплены. Известны и обратные случаи: у гриба Melampsora lini обнаружено тесное сцепление двух генов, дающих дефинитивную реакцию с генами льна, картируемыми в двух несцепленных локусах.
Казалось бы, подобные гипотезы легко поддаются проверке. Необходимо выделить препараты клеточных стенок у вирулентной и авирулентной к какому-либо сорту растения рас паразита и показать различия в индукции ими защитных реакций. Например, базидиоспоры возбудителя ржавчины вигны Uromyces vignae проращивали на голодном агаре, собирали эксудаты проростков и обрабатывали ими устойчивые и восприимчивые сорта вигны (табл. 7.1).
Как видно из таблицы, несовместимый ответ на обработку (СВЧ-реакция) возникает только в листьях сорта, имеющего доминантный аллель гена устойчивости, в ответ на эксудат расы, имеющей доминантный аллель гена авирулентности. В остальных случаях, в соответствие с правилом Флора реакция на эксудат на отличается от реакции на обработку водой. Во многих опытах специфичность метаболитов паразита пытались установить не по числу некротизированных клеток, а по накоплению в зоне заражения химических факторов устойчивости растений — фитоалексинов (ФА).
После демонстрации специфичности необходимо провести фракционирование препарата и выделить специфический индуктор (или, по общепринятой терминологии, предложенной Н. Кином, — элиситор), пометить его радиоактивным изотопом и обработать листья устойчивого растения или (что лучше) полученные из его клеток протопласты. После фракционирования белков плазмалеммы по наличию радиоактивной метки выделить белок, связывающийся с элиситором, и показать, что в восприимчивом сорте такого белка нет или, если есть, он имеет значительно более низкую константу связывания с элиситором. Далее можно секвенировать рецепторный белок и по его структуре синтезировать комплементарную цепочку ДНК (кДНК), использовав ее как гибридизационную пробу для выделения гена устойчивости из генома растения.
Однако, хотя к настоящему времени известно множество элиситоров, только некоторые из них получены в виде высоко очищенных препаратов (табл. 7.2). Сырые же препараты таят в себе много опасностей:
1) в неочищенном экстракте могут содержаться различные элиситоры, действующие синергетически, причем они могут быть близкими по структуре, что затрудняет очистку индивидуальных соединений;
2) при экстракции может возникнуть комплекс элиситора с иным веществом;
3) элиситор может быть активным только в присутствии некоего кофактора, который теряется при очистке;
4) выход элиситора может зависеть от условий культивирования, возраста культуры и других факторов.
Кроме того, экспериментаторы из разных стран столкнулись с трудностями иного порядка. Во-первых, индукцию защитных реакций вызывал не один какой-либо метаболит паразита, в многие метаболиты, локализованные в разных компартментах клетки (мембране, стенке, периплазме, цитозоле) и относящиеся к разным классам химических соединений (углеводам, белкам, жирным кислотам и др.). Во-вторых, элиситорные соединения обнаружены как у авирулентных, так и у вирулентных рас, и даже у сапротрофных грибов (приведенный в табл. 7.1 пример — счастливое исключение). В-третьих, эти элиситоры вызывали защитные реакции, как у устойчивых, так и у восприимчивых сортов растений, в том числе у видов и сортов, не имеющих генов ВУ к данному паразиту. Были предложены модели, по которым специфические или внутриклеточные неспецифические элиситоры образуются или освобождаются в окружающую среду только in planta под воздействием метаболитов растения-хозяина. Если это так, то при изучении элиситорных соединений, образующихся у паразита in vitro, действие специфических элиситоров будет замаскировано неспецифическими. Однако подобные гипотезы также плохо поддавались проверке.
Исходя из вышесказанного, можно выделить несколько групп элиситоров. Во-первых, это элиситоры, выделенные из патогенов или сред, в которых они росли (экзогенные биогенные элиситоры); во вторых, это элиситоры, образовавшиеся в зараженном растении (эндогенные биогенные элиситоры), и, в-третьих, это абиогенные элиситоры, не имеющие отношения к патогенезу. Биогенные или биотические элиситоры, в свою очередь, можно разделить на неспецифические и специфические. Абиогенные элиситоры всегда неспецифические (рис. 7.2).
Результаты описанных выше исследований, в которых показана не-специфичность большинства изолированных элиситоров патогенов, привели многих биохимиков, занимающихся изучением механизмов иммунитета растений, к представлениям о том, что индукция паразитом защитные реакций и их протекание в растении неспецифичны, а гены устойчивости и авирулентности недефинитивны. Специфична же супрессия (подавление) защитных реакций паразитом и отзывчивость хозяина на супрессор. Флоровская диаллельная схема взаимодействий хозяина и паразита (квадратная сетка) оказалась перевернутой (рис. 7.3). В некоторых комбинациях гриб — растение-хозяин подобные схемы получили экспериментальное подтверждение и специфические супрессоры были идентифицированы.
