Гены авирулентности и специфические элиситоры
Исследование структуры многочисленных неспецифических элиситоров при отсутствии специфических заставило, как было сказано выше, рассматривать процесс индукции устойчивости как неспецифический, а специфичность видеть в супрессии защитных реакций. Противоречия между данными генетических и биохимических исследований по вопросу о том, что является специфичным — индукция или супрессия, были разрешены методами молекулярной генетики. Для получения ответа на поставленный вопрос были использованы две методологии.
Получение мутаций гена, определяющего специфичность, и изучение реакции растения на заражение мутантным штаммом. Зондами для идентификации генов специфичности могут быть измененные последовательности информационных молекул или мобильные элементы генома (транспозоны).
У большинства фитопатогенных вирусов геном содержит всего несколько цистронов, поэтому доступен для полного секвенирования (определения последовательности оснований нуклеиновой кислоты). Поэтому для идентификации avr-генов можно использовать искусственно-полученные мутанты или даже природные варианты вируса с измененной вирулентностью.
У клеточных организмов для идентификации avr-генов используют транспозонный мутагенез. Транспозоны (tn) или инсерционные последовательности (is) представляют собой участки ДНК с повторяющимися последовательностями оснований на концах. Благодаря такой структуре они могут встраиваться в разные участки цепочки ДНК, при этом ген, в который внедрился транспозон, может быть полностью или частично инактивирован. Среди трансформированных транспозоном клеток отбирают по реакции на заражение клетки с измененной вирулентностью, выделяют из них ДНК и гибридизацией с транспозоном (зондом) определяют участок ДНК, ответственный за вирулентность.
Трансформация гена вирулентности из одних штаммов в другие. Для ее проведения необходимо: 1) с помощью ферментов, разрезающих молекулу ДНК (рестриктаз), разбить геном паразита на отдельные фрагменты; 2) клонировать их в модельном организме (кишечной палочке), создав библиотеку генов; 3) соединить их с вектором, в который встроен маркерный ген (устойчивости к антибиотику, прототрофности), необходимый для отбора трансформированных клеток; 4) обработать вектором протопласты реципиентного штамма и по маркерному гену отобрать трансформированные клетки; 5) по изменению реакции растения на заражение отобрать клон, в который встроен участок ДНК, отвечающий за специфическую патогенность (табл. 7.3). Если специфичность обусловлена индукцией устойчивости (специфическая индукция), то реакция сорта А на заражение трансформированной расой b изменится с восприимчивой на устойчивую, а сорт В сохранит реакцию устойчивости (1-й вариант). Если же специфичность обусловлена супрессией устойчивости, то, наоборот, реакция сорта В изменится с устойчивости на восприимчивость, а сорт А останется восприимчивым (2-й вариант).
Сложность данной методики обусловлена необходимостью отбора среди большого числа фрагментов ДНК из библиотеки генов фрагмента, связанного со специфической вирулентностью. Вопрос можно сформулировать так: сколько трансформантов надо проверить на растении, чтобы с высокой степенью вероятности среди них был обнаружен искомый? Число трансформантов можно установить с помощью следующего уравнения:
N = ln (1 - P) / ln (1 - f),
где P — вероятность присутствия гена, a f — часть генома, представленная в одном клоне. Например, если размер генома бактерий из рода Erwinia составляет 4,5 х 10в6 пар нуклеотидов (нп), а средний размер клонированных фрагментов — около 15 тысяч пар (тнп), то с вероятностью P = 0,99 искомый ген может быть обнаружен в одном из 1500 трансформантов. Следовательно, необходимо по маркерному гену отобрать более 1500 трансформированных клонов, в которые встроен вектор, и каждым клоном индивидуально заразить растение-хозяина, чтобы выделить клон с измененной вирулентностью. Для облегчения работы рекомендуют а) использовать крупнощепящие рестриктазы, разбивающие молекулы ДНК на большие фрагменты; б) в качестве вектора использовать конструкции, способные нести крупные фрагменты ДНК (космиды, ДНК фага λ).
Рассмотрим результаты использования описанных выше и других методов анализа avr-генов и специфических элиситоров у разных паразитов.