Программы развития клубенька бобовых

Взаимодействие бобовых с ризобиями приводит к образованию специальных органов, клубеньков, в которых формируется ряд межклеточных и внутриклеточных ниш (компартментов), используемых для размещения бактерий и для их тесных контактов с клетками растений (рис. 11.1). В результате прохождения через серию симбиотических ниш, бактерии переходят от эпифитной (на поверхности корней) к эндофитной, а затем и к внутриклеточной локализации. Благодаря сигнальному диалогу растений и бактерий, бобово-ризобиальное взаимодействие организовано в цепь событий с координированной экспрессией многочисленных генов, которые функционируют как компоненты глубоко интегрированных надорганизменных генетических систем.
Онтогенез клубенька. Наиболее полная программа развития характерна для недетерминированных клубеньков, образуемых бобовыми «галегоидного комплекса», среди которых детально изучены представители родов горох Pisum, люцерна Medicago, клевер Trifolium из трибы Trifolieae (рис. 11.1А). Развитие их клубеньков начинается с пре-инфекционных взаимодействий, в ходе которых ризобии узнают своих хозяев и колонизируют их корневые поверхности. Развитие клубеньков у клевера, гороха и люцерны начинается с проникновения ризобий в корневые волоски, которые при этом деформируются и скручиваются. В местах резкого сгиба волоска происходит локальное разрушение клеточной стенки и впячивание плазмалеммы, обеспечивающее проникновение бактерий в клетку эпидермиса. При этом бактерии оказываются заключенными в трубчатую структуру — инфекционную нить (ИН), стенки которой являются продолжением растительных клеточных стенок, а внутреннее пространство содержит матрикс, синтезируемый обоими партнерами. Хотя ИН развиваются как между растительными клетками, так и внутри них, бактерии при этом сохраняют межклеточную локализацию.

Одновременно с развитием ИН в клетках кортекса начинается дедифференцировка и митотическая реактивация клеток, в результате чего формируются зоны активных клеточных делений — примордии клубеньков. По мере их роста осуществляется тканевая дифференцировка, которая приводит к формированию покровных, проводящих (периферийных) и Н2-фиксирующих (центральных) тканей клубеньков. Через несколько дней после своего образования ИН, содержащие бактерии, достигают растущих приморди-ев и колонизируют их благодаря активному росту и ветвлению.
Ключевая стадия развития симбиоза — освобождение бактерий из «инфекционных капель» в растительную цитоплазму, осуществляемое в ходе процесса, сходного с эндоцитозом (рис. 11.2). Инфекционные капли представляют собой лишенные клеточной стенки участки ИН, в которых ризобии входят в контакт с растительной клеточной мембраной. Результатом этого является переход в растительную цитоплазму мембранных пузырьков, содержащих бактерии. Бактериальная клетка (группа клеток), окруженная единой мембраной, представляет собой основной субклеточный симбиотический компартмент — симбиосому, которую можно с полным основанием считать временной органеллой симбиотической клетки. Внутри нее ризобии дифференцируются в бактероиды, которые существенно превышают по размеру свободноживущие бактерии и отличаются от них по форме (для гороха характерны X- и Y-образные бактероиды; рис. 11.3). Окружающие их перибактероидные мембраны (ПБМ) возникают из плазмалеммы и развиваются путем включения телец аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулюма.

Выраженная дифференцировка характерна и для инфицированных ризобиями растительных клеток. Они обладают резко увеличенным количеством мембранных структур, участвующих в развитии ПБМ и в биосинтетических процессах. Последние приводят к образованию de novo многочисленных белков (нодулинов), участвующих в энергетическом снабжении нитрогеназы, ассимиляции азота и в поддержании физиологических условий, оптимальных для азотфиксации, в первую очередь, низкой концентрации O2.

Описанная программа развития клубеньков характеризует лишь небольшую часть бобовых: у некоторых представителей подсемейства мотыльковых (соя, фасоль — триба Phaseoleae; лядвенец — триба Loteae) формируются морфологически более простые детерминированные клубеньки (рис. 11.1 Б; табл. 11.3). Меристема в них существует лишь в течение нескольких дней, и после ее исчезновения рост клубеньки и обновление азотфиксирующей ткани прекращаются. Важной особенностью этих клубеньков является то, что клетки ризобий колонизируют митотически активные клетки апикальной меристемы, тогда как в недетерминированных клубеньках она остается не инфицированной. В центральной части детерминированных клубеньков отсутствует тканевая зональность, однако инфицированные клетки (где происходит фиксация N2) перемежаются с не инфицированными клетками (где образуются транспортные формы азота).

У некоторых мотыльковых (роды Arachis, Stylosanthes, триба Aeschynomeneae) развитие клубеньков происходит по упрощенной схеме: а) ризобии проникают в корень через разрывы эпидермиса; б) ИН не формируются, и ризобии подвергаются эндоцитозу из межклеточных пространств. Примитивная морфология симбиоза характерна для некоторых бобовых из подсемейства Ceasalpinioideae. Немногочисленные клубенькообразующие представители этого подсемейства (например, некоторые виды Cassia) образуют недетерминированные клубеньки, в которых эндоцитоз отсутствует и фиксация N2 осуществляется ризобиями, находящимися в модифицированных ИН, называемых «фиксационными нитями». Такая же морфология клубеньков выявлена у деревянистых представителей мотыльковых, Andira и Hymenolobium.
Особая программа развития характерна для актиноризы, которую формируют N2-фиксирующие актиномицеты Frankia с деревянистыми двудольными из 8 семейств, родственных бобовым (все они входят в кладу Rosid I): Betulaceae, Casuarinaceae, Coriariaceae, Datiscaceae, Elaegnaceae, Myricaceae, Rhamnaceae, Rosaceae. Актиноризные клубеньки характеризуются «корневой» топологией (проводящие пучки расположены в центре), которая отличается от «стеблевой» топологии клубеньков бобовых (с периферическими проводящими пучками). Актиноризные клубеньки возникают из примордиев боковых корней, имеющихся в перицикле, содержат ИН, однако варьируют, как и клубеньки бобовых, по стабильности апикальных меристем и по способу инфицирования (через корневые волоски или через разрывы эпидермиса). «Корневая» топология клубеньков характерна и для Parasponia (единственный род небобовых растений из семейства Ulmaceae, образующий клубеньки с ризобиями) у которых азотфиксирующие бактерии остаются внутри фиксационных нитей и не подвергаются эндоцитозу.
Контроль над развитием клубеньков. Гены растений, вовлеченные в симбиоз, разделяют на две группы: Sym-гены и гены нодулинов. Они были выявлены с использованием разных подходов: Sym-гены — путем классического генанализа (начиная с получения моногенно наследуемых мутаций по развитию клубеньков и заканчивая клонированием и секвенированием выявленных генов); гены нодулинов — с использованием методологии «обратной генетики», т. е. путем молекулярной идентификации продуктов (белков-нодулинов или РНК, синтезируемых de novo в клубеньках), которая позволяет проводить поиск в геноме последовательностей, кодирующих вновь синтезируемые продукты. Нодулины синтезируются в легко детектируемых количествах, что часто связано с наличием у растений нескольких копий этих генов. Обычно нодулины выполняют специфические структурные или биохимические функции симбиоза. В противоположность этому, Sym-гены представлены в геноме уникальными копиями, без чего мутанты по данным генам не могли бы быть отобраны. Экспрессия некоторых Sym-генов может активироваться еще до инокуляции растений бактериями, и в этом случае с началом симбиоза в выполнение функций клубенька включаются уже готовые генные продукты.
Многие гены нодулинов уже клонированы и секвенированы, однако выводы об их функциях до сих пор носят предварительный характер, так как они основаны на гомологиях с ранее выявленными генами или на локализации генных продуктов в симбиотических структурах. Ранние нодулины (ENODs — early nodulins), синтезируемые до начала фиксации N2, могут представлять собой компоненты вновь образуемых симбиотических компартментов (ИН, симбиосом), например, ENOD5 и ENOD12 накапливаются в стенках ИН. Нодулин 26 образуется во время эндоцитоза как компонент ПБМ (что связано с наличием в его структуре множественных трансмембранных доменов) и может участвовать в транспорте сигналов или питательных веществ между партнерами. ENOD40, по-видимому, вовлечен в контроль гормонального статуса (баланс ауксинов и цитокининов), так как его экспрессия индуцируется при воздействии ингибиторов синтеза или транспорта ауксинов. Сам ENOD40 синтезируется в перицикле под действием гормональных факторов, поступающих в корень через проводящую систему.

Организующую роль в программе симбиоза обычно связывают с действием Sym-генов (табл. 11.4). К настоящему времени выявлено свыше 50 Sym-генов и их число приближается к насыщению. Порядок действия этих генов был определен с использованием двойных мутантных линий, которые подвергают обратным скрещиваниям с исходными одиночными мутантами: наиболее рано действующим считают тот из двух генов, одиночный мутант по которому имеет тот же фенотип, что и двойной мутант. В настоящее время порядок функционирования Sym-генов для ранних стадий симбиоза подробно изучен у модельных бобовых — однолетней люцерны (Medicago truncatula) и лядвенца японского (Lotus japonicus). Для поздних стадий симбиоза (эндоцитоз, фиксация N2), наиболее подробные генетические данные получены для гороха посевного, Pisum sativum.
Фенотипическая характеристика большого числа мутантов позволяет классифицировать эти гены в соответствии с контролируемыми стадиями развития клубенька. Многие Sym-гены оказались вовлеченными в две параллельные подпрограммы развития симбиоза (инфицирование корней и развитие тканей клубенька), хотя порядок их функционирования в этих подпрограммах не является идентичным (рис. 11.4). Некоторые Sym-гены участвуют только в одной из этих подпрограмм, например, у гороха получены мутанты, дефектные по индукции развития клубенькового примордия, но сохранившие способность вызывать скручивание и инфицирование корневых волосков.

Н.А.Проворов, Н.И.Воробьев Генетические основы эволюции растительно-микробного симбиоза. Под ред. Тихоновича И.А.-СПб:Информ-Навигатор, 2012 .С17-23