Гены барназы и barstar-ген

Интенсивно разрабатываемые биотехнологические подходы к повышению устойчивости растений к грибным фитопатогенам с использованием генов, контролирующих синтез хитиназ, глюконаз или белков, инактивирующих рибосомы а также низкомолекулярных фунгитоксичных соединений, таких как фитоалексины, могут привести к реальному созданию высоко устойчивых сортов. Следует, однако, учитывать, по крайней мере, некоторые предсказуемые заранее недостатки такого подхода. Высокий уровень устойчивости полученных таким путем трансгенных растений будет, видимо, обусловлен специфичностью используемых механизмов. Избирательная устойчивость к узкой таксономической группе фитопатогенов не выгодна с агрономической точки зрения.
Теоретически высокоспецифические защитные барьеры растения-хозяина легче преодолеваются патогеном в результате, например, одной или нескольких мутаций в геноме гриба. В этой связи представляется наиболее приемлемым, с точки зрения сельскохозяйственной практики, использовать для получения трансгенных растений с множественной устойчивостью к грибным болезням гены, ответственные за естественные механизмы неспецифической защиты, такие, например, как реакция сверхчувствительности. Преодоление патогеном такого типа защиты теоретически должно быть значительно труднее и займет больше времени, нежели в случае высокоспецифических механизмов болезнеустойчивости.
Одним из возможных подходов к искусственно созданной реакции сверхчувствительности, сопровождаемой быстрой гибелью клеток восприимчивого сорта является синтез цитотоксичных соединений в тканях хозяина. Успешность применения такого подхода зависит от возможности локализовать цитотоксический эффект в пределах инфицированных клеток.
Это может быть достигнуто путем экспрессии генов цитотоксинов под контролем промотера, который специфически активировался бы только в ответ на внедрение патогена в ткани растения. Другой возможный путь достижения такого типа защиты — это подавление синтеза цитотоксина во всех не-инфицированных клетках.
В промотере картофельного защитного гена prp1-1 имеется регуляторный участок, который в норме не активен, но способен быстро и локализовано активировать транскрипцию контролируемого гена в ответ на внедрение грибного патогена. Этот участок промотера не реагирует на воздействие абиотических факторов и неактивен в неинфицированной ткани любого типа.
Ген барназы, выделенный из Bacillus amyloliquefaciens, кодирует РНКазу, которая обладает высокой цитотоксической активностью. Была создана генно-инженерная конструкция, в которой ген барназы был помещен под контролем вышеупомянутого фрагмента prp1-1 промотера (рис. 14.9). Для того чтобы свести к минимуму возможность разрушительного действия барназы в неинфицированных тканях, в геном тех же клонов была введена химерическая генная конструкция, представляющая собой barstar ген под контролем 35S промотера ВМЦК. Barstar, также выделенный из В. amyloliquefaciens, является суппрессором активности барназы. Созданную конструкцию использовали для трансформации восприимчивых к фитофторозу сортов картофеля. Трансгенные растения оказались более устойчивыми к фитофторозу по сравнению с исходными нетрансгенными растениями, что выразилось в задержке спороношения и в снижении продукции спорангиев, образующихся на поверхности листьев.

У части трансгенных клонов наблюдались резко выраженные морфологические изменения в листьях вплоть до разрушения листовой ткани, не связанное с заражением грибом. Эти линии не использовались в дальнейшей работе. Возникновение таких вариантов среди трансгенов свидетельствует о том, что эффективность защиты, обусловленной двухкомпонентной системой, зависит от баланса между экспрессией двух целевых генов и что этот баланс у различных линий может быть сдвинут в ту или иную сторону.
Для проверки экспрессии целевого гена барназы линии трансгенного картофеля с нормальной морфологией листьев обрабатывали этиленом (химический индуктор, активирующий промотор prp1-1). Результатом обработки этиленом была массовая деструкция листовой ткани трансгенных линий, из чего следует, что в клетках этих растений встроенный ген барназы действительно способен экспрессироваться в ответ на индукцию prp1-1 промотора.
Слабо выраженную устойчивость трансгенных растений в данном случае можно, по-видимому, объяснить либо высоким уровнем конститутивной экспрессии гена barstar, либо низкой индуцирующей активностью промотера prp1-1 в ответ на грибную инфекцию. Для достижения оптимального баланса между экспрессией двух целевых генов необходимо либо заменить 35S промотор ВМЦК на менее активный промотор, либо найти более чувствительный промотор для гена барназы.
Альтернативной моделью, генерирующей быстрый и эффективный защитный барьер в виде погибающих клеток в зоне внедрения патогена, может быть одновременная трансформация растений генами авирулентности грибного патогена и соответствующим геном устойчивости растения-хозяина.